Due delle questioni irrisolte ma importanti in epigenetica sono se esistano le arginine demetilasi (RDM) e se la scissione proteolitica delle code degli istoni e il successivo rimodellamento degli istoni siano un importante processo di modifica epigenetica. Le proteine contenenti il dominio Jumonji (JmjC) sono state caratterizzate come demetilasi della lisina (KDMs) in un certo grado (Klose et al., 2006). Evidenze emergenti indicano che catalizzano anche la reazione di demetilazione sui residui di arginina e la rimozione proteolitica delle code degli istoni. Questi processi sono probabilmente associati a significati biologici. Questa ricerca ha lo scopo di fornire una visione a volo d’uccello dello stato attuale delle proprietà biochimiche espanse delle proteine contenenti JmjC come RDMs ed enzimi di clipping della coda dell’istone dipendenti dalla metilazione.

Le proteine contenenti JmjC sono una famiglia di ossigenasi non ferrose (II) e 2-ossoglutarati (2OG o α-chetoglutarati) dipendenti con una caratteristica struttura a doppio filamento e a foglio β antiparallelo. Un esempio di JMJD5 (PDB 4gjy) è mostrato nella Figura 1A. Il nostro completo allineamento strutturale tridimensionale (3D) delle strutture cristalline disponibili di 23 proteine contenenti JmjC indica che l’asparato/glutammato precedentemente identificato e due residui di istone coordinano il ferro (II) cofattore, mentre due residui contenenti anelli aromatici (W, Y, o F) svolgono un ruolo critico nella stabilizzazione sia del ferro (II) che della tasca catalitica con interazioni π-catione (Figura 1A). La famiglia è stata classificata in sette sottofamiglie basate sulle loro sequenze (Klose et al., 2006). Il nostro allineamento strutturale 3D con TM-score heatmap conferma tale clustering (Figura 1B). Un nuovo membro della famiglia, TYW5, che potrebbe rientrare nella sottofamiglia orfana è stato identificato durante la nostra recente ricerca (Figura 1C). Finora, 22 dei 31 membri della famiglia sono stati segnalati per possedere un’attività KDM sui siti K4, K9, K27, e K36 dell’istone 3 così come substrati non istonici in forme mono-, di-, e tri-metilazione (Figura 1C). È prevedibile che l’attività di demetilazione del resto delle proteine contenenti JmjC e la loro attività su ulteriori substrati saranno identificate dopo la disponibilità di tecnologie come anticorpi specifici e una sensibile spettrometria di massa. Gli enzimi sono altamente espressi durante lo sviluppo ematopoietico e possono avere un ruolo importante negli animali superiori e nell’uomo. Attualmente, la maggior parte delle funzioni biologiche identificate delle proteine contenenti JmjC sono attribuite alla loro attività KDM.

Mentre le arginine metil transferasi sono state identificate e la loro funzione nelle cellule sono state ben documentate (Yang e Bedford, 2013; Fuhrmann et al, 2015), le RDM non sono ancora state identificate. Jmjc domain-containing 6 (JMJD6) è stato precedentemente riportato come una RDM putativa per i substrati istone H3 e H4 di dimetilarginina asimmetrica (ADMA) e dimetilarginina simmetrica (SDMA) (Chang et al., 2007). Tuttavia, questa funzione è stata oggetto di rapporti contrastanti. Due rapporti successivi hanno indicato che JMJD6 catalizza solo l’idrossilazione 2OG-dipendente C-5 dei residui di lisina nelle proteine regolatrici dello splicing del mRNA e negli istoni (Webby et al., 2009; Mantri et al., 2010). Più recentemente, uno studio ha dimostrato che alcune KDMs possiedono attività RDM su substrati modello peptide istone metilato (Walport et al., 2016) (Figura 1C). Il meccanismo catalitico per le proteine JmjC catalizza l’idrossilazione dei legami C-H e la N-demetilazione tramite idrossilazione (Figura 1D). Il sito attivo Fe(II) è legato da HXD/E…H e dal cofattore 2OG. In assenza di substrati, le ossigenasi 2OG-dipendenti spesso catalizzano una reazione lenta e disaccoppiata in cui 2OG è decarbossilato per formare succinato, anidride carbonica e un intermedio reattivo Fe(IV)=O ferryl. L’aggiunta di substrati nella reazione stimolerà drasticamente il processo. Questo intermedio ferro(IV)-oxo ossida poi il legame C-H e porta alla formazione di un prodotto idrossilato. Se l’idrossilazione avviene sul gruppo metile di un amidogeno, questo processo formerà un emimino instabile. L’idrossimetile viene probabilmente rilasciato spontaneamente come formaldeide, risultando in un substrato demetilato. Il processo non discrimina la metilarginina dalla metilisina. L’idrossilazione è un passo intermedio della demetilazione.

E’ stato riportato recentemente che due proteine orfane contenenti JmjC, JMJD5 e JMJD7, hanno attività di proteasi dipendenti da cationi divalenti che scindono preferenzialmente le code dell’istone 3 o 4 contenenti lisina o arginina metilata (Figura 1C). Dopo la scissione specifica iniziale, JMJD5 e JMJD7, agendo come aminopeptidasi, digeriscono progressivamente i prodotti C-terminali, che è un’attività peptidasica dipendente dalla metilazione e definita anche come clipping (Liu et al., 2017; Shen et al., 2017). Tra le 23 proteine contenenti il dominio JmjC con strutture cristalline, la maggior parte di esse contiene Zn2+ oltre a Fe2+, il che aumenta la possibilità per le proteine contenenti JmjC di agire come metalloproteasi dipendenti dal gruppo metile. I membri orfani della sottofamiglia come JMJD5 hanno solo due residui per coordinare Zn2+, che potrebbero essere flessibili per la reazione peptidasica, in modo simile a quelli delle metalloproteasi. Al contrario, i membri delle sottofamiglie PHF2/PHF8 e JMJD2/JHDM3 hanno quattro residui per coordinare Zn2+, che è rigido, sepolto e non accessibile al substrato. Per le sottofamiglie JARID e UTX/UTY, Zn2+ è lontano dal centro di catalisi Fe(II), il che rende difficile una reazione coordinata tra il riconoscimento del gruppo metile e il clipping. Ulteriori esperimenti sono giustificati per verificare se lo stato di Zn2+ nelle proteine è un fattore determinante per tale clivaggio. Il significato biologico di tale reazione non è ancora chiaro, ma potrebbe essere coinvolto nella regolazione trascrizionale, nella risposta ai danni al DNA e nell’apoptosi per esaurire rapidamente gli istoni e rimodellare la struttura della cromatina per esporre il DNA alle reazioni necessarie.