Culture cellulari e RNAi

La linea cellulare di Drosophila melanogaster S2 (dalla collezione di IMG RAS) e la linea cellulare Kc167 (dal Drosophila Genomics Resource Center) sono state coltivate a 25 °C in Schneider’s Drosophila Medium (Gibco) integrato con 10% di feto bovino inattivato al caloresiero bovino fetale inattivato al calore (FBS, Gibco), 50 unità/ml di penicillina e 50 µg/ml di streptomicina. OSCs47 gentilmente forniti da M. Siomi sono stati coltivati in Shields e Sang M3 insetto medio (Sigma-Aldrich) integrato con 10% inattivato al calore FBS (Gibco), 10% estratto di mosca (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml insulina (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutatione (Sigma-Aldrich), 50 unità / ml penicillina, e 50 µg / ml streptomicina. DsRNA contro lacZ o lamin Dm0 per il trattamento RNAi di cellule S2 sono stati preparati come precedentemente descritto 11. DsRNA contro LBR sono stati preparati nello stesso modo utilizzando il DNA del genoma di Drosophila come modello per l’amplificazione PCR e primer forniti nella tabella supplementare 1. Trattamento delle cellule con dsRNA è stata eseguita in quattro giorni utilizzando un protocollo precedentemente descritto48.

Western-blot analisi

Le proteine sono state estratte con 8 M urea, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1% SDS, frazionato da SDS-PAGE (12% gel di acrilammide) e trasferito su una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore). I blot sono stati sviluppati utilizzando anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina (Sigma) e il sistema di rilevamento Immun-Star AP (Bio-Rad). I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per la rilevazione: monoclonale murino anti-lamina Dm0 (1:2000; ADL6749), policlonale di coniglio anti-lamina C25 (1:10000), monoclonale murino anti-beta Actin (1:3000; ab8224, Abcam).

Visualizzazione della cromatina mediante colorazione dell’istone H4 o DAPI

Le cellule Lam-KD, LBR-KD o di controllo S2 sono state seminate su coprioggetti per 30 minuti. Dopo il risciacquo con PBS, le cellule sono state fissate in metanolo al 100% per 5 min a temperatura ambiente (per un ulteriore esame della distribuzione della cromatina basata sull’immunocolorazione dell’istone H4) o in formaldeide al 4% in PBS per 25 min a temperatura ambiente (per un’ulteriore stima del volume della cromatina basata sulla colorazione DAPI), sciacquate con PBS tre volte, bloccate con PBTX (PBS con 0,1% Tween-20 e 0,3% Triton X-100) contenente 3% di siero di capra normale (Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente. La procedura rimanente immunostaining è stata eseguita come precedentemente descritto50. Come anticorpi primari abbiamo usato monoclonale murino anti-histone H4 (1:200; ab31830, Abcam), cavia policlonale anti-LBR26 (1:1000), coniglio policlonale anti-lamina Dm051 (1:500). Come anticorpi secondari abbiamo usato Alexa Fluor 546 coniugato capra anti-rabbit IgG (Invitrogen) o Alexa Fluor 488 coniugato capra anti-mouse IgG (Invitrogen), o Alexa Fluor 633 coniugato capra anti-porcellino d’India IgG (Invitrogen).

ImageJ quantificazione della distribuzione della cromatina

Usando ImageJ, abbiamo misurato i profili di istone H4, LBR e lamin Dm0 attraverso il diametro del nucleo del piano focale equatoriale di nuclei di Lam-KD, LBR-KD o cellule S2 di controllo. Le intensità di fluorescenza sono state estratte, i singoli profili sono stati prima normalizzati sull’intensità media, poi sul diametro del nucleo (delimitato da picchi di fluorescenza LBR per Lam-KD, o da picchi di fluorescenza lamin Dm0 per LBR-KD) e ulteriormente allineati per determinare il profilo medio. Nuclei da 2-3 esperimenti indipendenti (60 nuclei per esperimento) sono stati analizzati.

Stima del volume della cromatina macchiata con DAPI

Immagini confocali contenenti 20-30 DAPI macchiati in formaldeide Lam-KD o cellule S2 controllo sono stati elaborati e analizzati con gli stessi parametri utilizzando IMARIS 7.4.2 software (Bitplane AG). Solo i nuclei con il più basso residuo di colorazione lamin Dm0 sono stati utilizzati per l’analisi in cellule Lam-KD, mentre nelle cellule di controllo, al contrario, i nuclei con scarsa colorazione lamin Dm0 non sono stati presi per l’analisi. Per la sottrazione dello sfondo, le immagini sono state sogliate a ~15% dell’intensità massima del canale in modo che le superfici nucleari generate non si espandessero oltre il picco di intensità di fluorescenza LBR. Con questi parametri, le superfici dei nuclei, appropriate per l’analisi, sono state ricostruite automaticamente. Infine, i volumi di ~ 100 nuclei ricostruiti sono stati recuperati dalla scheda Statistiche per l’analisi.

FISH a due colori

~20-kb sonde FISH sono stati generati utilizzando un kit PCR a lungo raggio (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) mediante PCR-amplificazione di 4 frammenti di genoma tiling che coprono la regione 2 L:16964000-16982000 o 2 L:17310000-17328000, con l’uso di coppie di primer forniti nella Tabella 1 supplementare. 1 µg di DNA modello per l’ibridazione è stato etichettato mediante sintesi random primed con il kit di etichettatura DIG DNA (Roche) o con ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Le sonde sono state ulteriormente combinate e ibridate con cellule S2 come descritto in precedenza23. Per NL o FISH rilevamento sonda, come gli anticorpi primari abbiamo usato cavia policlonale anti-LBR26 (1:1000), o coniglio policlonale anti-lamina Dm051 (1:500) e pecora policlonale anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Come anticorpi secondari abbiamo usato Alexa Fluor 633 coniugato capra anti-porcellino d’India IgG (Invitrogen), o Alexa Fluor 546 coniugato capra anti-coniglio IgG (Invitrogen) e Alexa Fluor 488 coniugato capra anti-FITC IgG (Invitrogen).

Misurazione delle distanze tra le sonde FISH e la NE

Le pile di immagini tridimensionali sono state registrate con un microscopio a scansione laser confocale LSM 510 Meta (Zeiss). Sono state catturate sezioni ottiche con intervalli di 0,4μm lungo l’asse Z. Le immagini sono state elaborate e analizzate utilizzando il software IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) con il setup sperimentale cieco. Distanze tra entrambe le sonde o tra le sonde e la NE sono stati contati come precedentemente descritto 23. Brevemente, non siamo stati in grado di ricostruire completamente le superfici dei nuclei automaticamente sulla base della loro LBR o lamin Dm0 immunostaining. Pertanto, il bordo nucleare di un particolare nucleo è stato delineato manualmente in tutte le sezioni ottiche della pila dal centro del suo LBR o lamin Dm0 colorazione per ricostruire ulteriormente la superficie di questo nucleo automaticamente. Per determinare la distanza tra i segnali FISH e la NE, lo strumento “punto di misura” è stato posizionato sul voxel più luminoso della sonda FISH e un altro “punto di misura” è stato posizionato sulla superficie nucleare ricostruita nel punto della sua prima intersezione con una sfera progressivamente crescente dal primo “punto di misura”. La distanza tra due “punti di misurazione” (cioè la distanza più breve tra il centro della sonda FISH e il centro della NE) è stata misurata per ogni nucleo. Le distanze tra due sonde FISH sono state misurate in modo corrispondente. I dati sono stati ottenuti in due esperimenti indipendenti per 75-100 nuclei per esperimento. In parallelo, i volumi dei nuclei sono stati recuperati, e i raggi dei nuclei sono stati calcolati considerando i nuclei come sferici. Infine, le distanze sono state normalizzate ai raggi nucleari.

Analisi dell’espressione genica

L’RNA totale è stato isolato da cellule Lam-KD o controllo S2 utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen), e il DNA contaminante è stato rimosso dal trattamento DNase I. La qualità dell’RNA è stata valutata mediante elettroforesi capillare con un Bioanalyzer 2100 (Agilent). Il Poly(A)+ RNA è stato estratto dall’RNA totale usando perline magnetiche oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). NEBNext Ultra II RNA library preparation kit (New England Biolabs) è stato utilizzato per la preparazione di librerie seguendo le istruzioni del produttore. Librerie da due replicati biologici di Lam-KD o cellule di controllo S2 sono stati quantificati utilizzando un fluorimetro Qubit e PCR quantitativa, e sequenziato sulla Illumina NextSeq con conseguente 8,4-9,4 × 106 80-nt single-end legge. Letture sono stati mappati al genoma di riferimento D. melanogaster (versione dm3) utilizzando HISAT52 v2.1.0 con opzione -max-intronlen 50.000. Letture con bassa qualità di mappatura sono stati rimossi utilizzando SAMtools53 con opzione -q 30. Abbiamo calcolato i livelli di trascrizione log2 in bins genomici di 20 kb usando BEDtools54 v2.16.2 con l’opzione -split, e poi applicato la funzione hclust in R per raggruppare i replicati usando il coefficiente di correlazione di 1-Spearman come metrica di distanza. L’espressione genica è stata quantificata con StringTie52 per l’annotazione di riferimento versione r5.12. Abbiamo filtrato i geni con espressione zero in più di due replicati. Tra i restanti 10.076 geni, i geni differenzialmente espressi sono stati definiti utilizzando il pacchetto edgeR55 con trimmed media dei valori M (TMM) normalizzazione a FDR = 0,05 cutoff. I geni sono stati assegnati ai LAD se i loro TSS erano situati all’interno dei LAD, mentre i geni sono stati assegnati agli inter-LAD se i loro TSS erano almeno 1-kb di distanza dai LAD. Uno pseudoconto è stato aggiunto a tutti i valori di espressione per eliminare gli zeri. Lo pseudoconte è stato calcolato come il valore minimo nella tabella di espressione genica dopo la normalizzazione. Poi, abbiamo fatto la media dei replicati e calcolato i valori log2(FC) tra Lam-KD e campioni di controllo.

Il test RT-qPCR in tempo reale per i geni selezionati a caso da diversi LAD è stato eseguito su cDNA sintetizzati con primer oligo(dT) sul poly(A)+ RNA isolato da 3 replicati biologici di Lam-KD o cellule S2 di controllo, utilizzando la chimica EvaGreen (Jena Bioscience) e l’hardware CFX96 (BioRad). I livelli di espressione dei geni sono stati normalizzati sull’espressione del gene act5C. Per la RT-PCR semiquantitativa, applicata per l’analisi dei geni della LAD 60D, la trascrizione inversa dell’RNA è stata eseguita utilizzando la trascrittasi inversa SuperScript II (Invitrogen) in presenza di primer esamerici casuali. L’amplificazione PCR dei cDNA è stata eseguita con l’aggiunta di 33P-dATP. Le sonde dopo la PCR sono state separate in PAAG al 5%, che è stato poi fissato, asciugato ed esposto allo schermo ai fosfori di stoccaggio (Amersham Biosciences). I segnali sono stati scansionati con un Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Per ogni coppia di primer il numero di cicli di PCR è stato ottimizzato per adattarsi alla fase esponenziale dell’amplificazione che è stata controllata da una diluizione del cDNA di due volte. I livelli di espressione dei geni sono stati normalizzati all’espressione del gene ubiquitario CG4589. Sequenze di primer gene-specifici sono presentati nella tabella supplementare 1.

ChIP-seq procedura e analisi dei dati

ChIP-seq da due replicati biologici di controllo e Lam-KD cellule S2 con anticorpi anti-H3-pan acetilato (Active Motif, # 39139) è stata eseguita come precedentemente descritto56, con alcune modifiche. Dopo il risciacquo con PBS, ~ 2 × 107 cellule sono state fissate con 1,8% formaldeide in PBS contenente 0,5 mM DTT per 20 min a temperatura ambiente. Cross-linking è stato fermato con l’aggiunta di glicina a 225 mM per 5 min e lavaggio in PBS contenente 0,5 mM DTT tre volte per 5 min. Le cellule sono state lavate una volta nel buffer A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7.6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% deossicolato di sodio, 0,5 mM DTT, completo EDTA-free cocktail inibitore della proteasi (Roche)). Le cellule sono state lisate nel buffer A2 contenente 1% SDS per 10 min a temperatura ambiente, dopo di che il lisato è stato diluito 20 volte dal buffer A2 e incubato per 2 min a 4 °C. Dopo la sonicazione con VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 impulsi di 10 sec con intervalli di 10 secondi al 15% di potenza massima) e 10 minuti di centrifugazione ad alta velocità, la cromatina frammentata (con la dimensione media del frammento di DNA ~ 0,5 kb) è stato recuperato nel surnatante. Per ogni immunoprecipitazione, ~10 μg di cromatina (~700 µl) sono stati pre-incubati in presenza di 100 μl di proteina A-Sepharose (PAS, 50% w/v, GE Healthcare) per 1 h a 4 °C. La PAS è stata rimossa per centrifugazione, il 5% della cromatina è stato isolato come materiale “Input”, dopodiché 2 µl di anticorpi anti-H3-pan acetilati (Active Motif, #39139) sono stati aggiunti al resto della cromatina e i campioni sono stati incubati una notte a 4 °C in una ruota rotante. Poi, sono stati aggiunti 100 μl di PAS e l’incubazione è stata continuata per 4 ore a 4 °C. I campioni sono stati centrifugati alla massima velocità per 1 min e il surnatante è stato scartato. I campioni sono stati lavati quattro volte nel buffer A2 contenente 0.05% SDS e due volte in 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0.5 mM DTT buffer (ogni lavaggio per 5 min a 4 °C). La cromatina è stata eluita dalla PAS in 100 μl di 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8) a 65 °C per 10 min, seguita da centrifugazione e recupero del surnatante. PAS materiale è stato ri-estratto in 150 ml di TE, 0,67% SDS. Per invertire i legami incrociati, l’eluato combinato (250 μl) è stato incubato 6 ore a 65 ° C e trattato con proteinasi K per 3 ore a 50 ° C. I campioni sono stati fenolo-cloroformio estratto e isopropanolo precipitato in presenza di 20 μg di glicogeno. Il DNA è stato sciolto in 100 μl di acqua. Campioni ChIP contenente ~ 25 ng di DNA precipitato, così come i campioni “Input” sono stati preparati per il sequenziamento di prossima generazione utilizzando un NEBNext Ultra II DNA kit di preparazione della libreria per Illumina (New England Biolabs). Librerie sono stati sequenziati sul Illumina HiSeq 2000 con conseguente 3.1-3.4 × 106 75-bp single-end legge. Letture sono stati mappati al genoma di riferimento D. melanogaster (versione dm3) utilizzando Bowtie 2 v2.2.1 (con l’opzione – molto sensibile) 57. Letture con bassa qualità di mappatura sono stati rimossi utilizzando SAMtools53 con opzione -q 30. Le letture duplicate sono state rimosse usando SAMtools rmdup. Abbiamo calcolato log2 ChIP e segnali di ingresso in 1-kb genomica bins utilizzando BEDtools54 v2.16.2, e poi applicato hclust funzione in R per raggruppare i replicati utilizzando 1-Spearman coefficiente di correlazione come metrica di distanza. Le letture sono state assegnate a LADs se si sono sovrapposte a LADs, mentre le letture sono state assegnate a inter-LADs se erano almeno 1-kb distanti da LADs. Abbiamo calcolato il numero di letture all’interno di ogni LAD e inter-LAD, normalizzato i valori per la somma della copertura di lettura per replicato, escluso i LAD e gli inter-LAD coperti da zero da ulteriori analisi, fatto la media dei replicati e calcolato i valori log2(FC) tra Lam-KD e campioni ChIP di controllo.

Procedura Hi-C e analisi dei dati

Hi-C librerie da due replicati biologici indipendenti di controllo e Lam-KD cellule S2 sono stati preparati essenzialmente come descritto in precedenza36 utilizzando l’enzima di restrizione HindIII-HF (NEB). Librerie sono stati sequenziati sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000 con conseguente 3-4 × 107 paired-end legge. Letture sono stati mappati al genoma di riferimento D. melanogaster (versione dm3) utilizzando Bowtie 2 v2.2.1 (con l’opzione – molto sensibile) 57. I dati Hi-C sono stati elaborati utilizzando la pipeline ICE v0.9 (20 iterazioni di correzione iterativa) come descritto58. Hi-C mappe di interazione con 20-kb risoluzione sono stati ottenuti. TADs sono stati predetti utilizzando il software Armatus59 v1.0, in cui la dimensione media e il numero di TADs è determinato dal parametro di scala γ. annotazione TAD è stata eseguita in due fasi come descritto36. In primo luogo, abbiamo selezionato manualmente parametro γ per ottenere una buona partizione di TADs (γ = 1,20 per Lam-KD cellule e γ = 1,12 per le cellule di controllo). Poi, i TAD più grandi di 600 kb sono stati divisi in TAD più piccoli con il parametro di scala γ moltiplicato per 2. In seguito, i TAD più piccoli (uguali o inferiori a 60 kb) sono stati annotati come inter-TAD a causa della loro struttura interna poco risolta. Come risultato, sono stati rivelati 576 (nel controllo) e 588 (in Lam-KD) TADs. Per esaminare se le posizioni TAD sono alterate su Lam-KD, abbiamo analizzato il grado di sovrapposizione di ogni TAD nei replicati fusi di controllo e cellule Lam-KD con quello nei replicati di controllo o nei replicati Lam-KD e non ha trovato differenza statisticamente significativa (P > 0,05 in un test Wilcoxon a due lati). ACF all’interno di ogni TAD è stato calcolato come un valore medio dei numeri letti iterativamente corretti tra tutti i bins genomici appartenenti al TAD, escludendo i bins di confine da entrambi i lati TAD. ACF all’interno di ogni inter-TAD è stato calcolato come un valore medio dei numeri letti iterativamente corretti tra tutti i bins genomici appartenenti all’inter-TAD e i bins di confine delle TAD adiacenti. Per ogni TAD, abbiamo calcolato il rapporto tra il valore ACF in ogni replica Lam-KD e il valore ACF in ogni replica di controllo (quattro rapporti in totale). I TAD con almeno tre rapporti dello stesso segno sono stati utilizzati per l’analisi a valle. Notiamo che quando abbiamo selezionato TADs secondo un criterio più rigoroso (cioè tutti e quattro i rapporti sono stati cambiati nella stessa direzione), non ha influenzato i risultati di analisi (Fig. 6 supplementare). Compartimenti di cromatina sono stati annotati utilizzando l’analisi delle componenti principali come descritto17. Trame sella sono stati generati come descritto58. Brevemente, abbiamo usato il osservato / atteso Hi-C mappe, che abbiamo calcolato da 20-kb iterativamente corretto mappe di interazione di cis-interazioni dividendo ogni diagonale di una matrice per il suo cromosoma-wide valore medio. In ogni mappa osservata/attesa, abbiamo riordinato le righe e le colonne nell’ordine di aumento dei valori PC1 (che abbiamo calcolato per le matrici di controllo). Infine, abbiamo aggregato le righe e le colonne della matrice risultante in 20 cestini aggregati di uguali dimensioni, ottenendo così un grafico a sella della compartimentazione.

Analisi dei dati pubblicati

Abbiamo impiegato l’annotazione del tipo di cromatina per le cellule S240. Sono state calcolate le proporzioni dei tipi di cromatina in bins da 20 kb. L’annotazione di LAD è stata ottenuta da rif. 28. Abbiamo calcolato la proporzione di lunghezza LAD in ogni bin 20-kb TAD.

Modellazione polimero

Abbiamo usato Dissipative Particle Dynamics (DPD) per eseguire simulazioni al computer, come precedentemente descritto36 con alcune modifiche. Brevemente, le macromolecole sono rappresentate in termini di modello bead-and-spring, con le particelle che interagiscono tramite una forza conservativa (repulsione), una forza dissipativa (attrito) e una forza casuale (generatore di calore). Una descrizione dettagliata dell’implementazione di questa tecnica è stata fornita in precedenza60. Il volume della cella simulata era 50 × 50 × 50 unità DPD, la densità è uguale a 3, quindi il numero totale di particelle nel sistema è 375.000. Assumiamo che una particella corrisponda a un nucleosoma. Inoltre, introduciamo speciali condizioni al contorno, che sono periodiche per il solvente e impermeabili per le altre particelle. La superficie consiste di particelle immobili, posizionate esagonalmente. Nelle nostre simulazioni, le particelle imitano i tipi di nucleosomi “attivi” o “inattivi”, mentre la superficie imita la NL. Le particelle “inattive” possono creare legami reversibili “saturanti “61,62 tra loro e con le particelle di una superficie. Ogni particella “inattiva” può avere un solo legame aggiuntivo per momento, il che simula un’interazione di una coda di istone caricata positivamente di un nucleosoma non acetilato con il “patch acido” di un altro nucleosoma42,43,63. La nostra catena di copolimeri è rappresentata da 64 blocchi, ciascuno composto da 500 particelle “inattive” e 50 “attive”. La probabilità di creare un’associazione tra due particelle “inattive” è stata impostata a 0,001, tra la particella “inattiva” e la superficie – 0,007, mentre la probabilità di rompere tale associazione è stata impostata a 0,01. Durante le simulazioni, tutte le particelle sono state controllate ogni 200 passi DPD, quando l’equilibrio locale è stato ottenuto. Abbiamo eseguito 10 esecuzioni indipendenti sul supercomputer MSU “Lomonosov-2” utilizzando la nostra implementazione per il codice DPD parallelizzato di decomposizione del dominio che è disponibile su GitHub.

Analisi statistica

Abbiamo applicato il test di Wilcoxon per verificare se la distribuzione dei valori log2(FC) fosse simmetrica intorno allo zero, così come per verificare se due distribuzioni di valori log2(FC) differissero per uno spostamento di posizione di zero.

Reporting Summary

Più informazioni sul disegno sperimentale sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.