Abbiamo impiegato fonti di nutrimento di glucosio, glucosio e glutammina per decifrare il flusso di carbonio nelle cellule K562 e i cambiamenti in risposta al trattamento BaP. Nel complesso, osserviamo la maggior quantità di incorporazione dell’etichetta in ribosio moieties e lattato (vedi e Additional file 1: Figura S1 per i dettagli sulle distribuzioni di etichetta). Come illustrato in Fig. 1, incorporazione etichetta nel ciclo di Krebs derivanti da glucosio può essere previsto per produrre due modelli distintamente diversi etichettatura dei metaboliti del ciclo di Krebs a seconda se il frammento C2 entra attraverso piruvato carbossilasi (PC) o piruvato deidrogenasi (PDH). Il piruvato formato dal glucosio produrrà glutammato tramite PDH, ma il glutammato tramite l’attività PC. Poiché l’attività della PC produce ossalacetato dal piruvato, ci si aspetta che il malato derivi dalla PC, mentre il prodotto della PDH sarà malato o malato.

Gli spettri NMR indicano che grandi quantità di aspartato e malato sono derivati dal PC

Come mostrato in Fig. 2, differenze significative sono osservate tra le cellule che elaborano il glucosio per 3 vs. 24 h per le risonanze di malato e aspartato. Queste differenze si manifestano principalmente in un cambiamento delle costanti di accoppiamento NMR. La dimensione di queste costanti di accoppiamento dipende dalla natura dell’atomo di carbonio adiacente: un gruppo acido carbossilico produce una costante di accoppiamento molto più grande di un gruppo CH2. La costante di accoppiamento per la parte 13C1 13C2 dell’aspartato o del malato è di circa 50-60 Hz, mentre la costante di accoppiamento per una parte 13C2 13C3 è di circa 35-40 Hz.

Per un periodo di etichettatura di 24 ore, la Fig. 2 mostra costanti di accoppiamento apparente di 53 Hz per C2 di malato e aspartato. Questa grande costante di accoppiamento apparente mostra che l’accoppiamento di C2 con l’adiacente gruppo acido carbossilico C1 predomina. Questo modello di accoppiamento 13C1 13C2 (e anche 13C3 13C4, vedi file aggiuntivo 1) deriva dall’attività PDH e forse anche da metaboliti che passano più volte attraverso il ciclo di Krebs per il periodo di etichettatura più lungo.

Per il breve periodo di etichettatura 3 ore, le costanti di accoppiamento apparente più piccolo di 47 e 41 Hz sono osservati per C2 (Fig. 2 e Additional file 1: Figura S1), indicando che l’accoppiamento al metilene adiacente C3 domina. La presenza della moiety 13C2 13C3 a periodi di etichettatura più brevi mostra che il prodotto derivante dall’attività PC domina per periodi di etichettatura più brevi.

Si deve notare che le scissioni di segnale osservate non rappresentano le costanti di accoppiamento scalari precise in una miscela di composti etichettati. Tuttavia, il cambiamento osservato fornisce una chiara indicazione di maggiori quantità del prodotto PC a periodi di etichettatura più brevi sia nel malato che nell’aspartato.

Ulteriore prova dell’attività PC nei sottospettri dell’uracile

Nella sintesi pirimidinica de novo, l’uracile si forma dall’aspartato tramite carbamoil-aspartato, orotato e diidroorotato. Pertanto, i modelli di etichettatura nell’aspartato dovrebbero riflettersi nei segnali dell’anello pirimidinico. File aggiuntivo 2: La figura S2 mostra le incorporazioni di etichette previste per l’uracile. Quando la base di uracile in UDP è sintetizzata da aspartato, la destinazione dei 13C è la seguente: C1, C2 e C3 dell’aspartato diventano rispettivamente C10, C11 e C12 dell’UDP mentre C4 viene perso (vedi file aggiuntivo 2). Negli spettri HSQC, solo C11 e C12 sono in grado di essere osservati direttamente, poiché C10 non ha un protone attaccato.

Per i campioni marcati con glucosio l’aspartato derivato dal PC sarà marcato C2C3. Questo viene convertito in un frammento C11C12 etichettato in UDP. Tuttavia, l’aspartato derivato dal PDH può essere etichettato a C1C2 o C3C4. Questo si traduce in C10C11 o in un C12 isolato nell’uracile, rispettivamente. Pertanto, gli spettri di C12 sono indicativi delle quantità relative di attività PC vs. PDH; PC produce un doppietto per C12, mentre PDH produce un singoletto a C12.

Tutti gli spettri hanno mostrato sia il singoletto che il doppietto a C12 (Fig. 3). Tuttavia, l’intensità del doppietto rispetto al singoletto cambiato tra 3 e 24 h dati da un fattore di tre, ancora una volta indicando un passaggio da PC a PDH-mediata etichettatura con il tempo. Il quadro che emerge da diversi metaboliti è che c’è un’attività parallela sia della PC che del PDH, ma il prodotto della PC è principalmente incanalato in prodotti direttamente legati all’ossalacetato, producendo l’elevata quantità osservata di prodotto PC in questi metaboliti in un’esposizione a breve termine. Solo in periodi di etichettatura più lunghi si osserva il prodotto PDH nel ramo sinistro del ciclo di Krebs.

BaP-è derivato dall’attività a valle della PC nelle cellule K562

Abbiamo dimostrato che il malonato può essere formato dall’ossalacetato mediante conversione chimica sotto l’influenza del perossido di idrogeno e abbiamo suggerito nel nostro studio precedente che l’accumulo di malonato in risposta al trattamento con BaP era guidato dall’aumento indotto dal trattamento dei ROS che agiscono sull’ossalacetato. I campioni sono stati dosati con malonato per confermare la nostra assegnazione delle risonanze 1H/13C del metilene malonato negli spettri HSQC (vedi file aggiuntivi 3 e 4). Successivamente, in questo studio, il nostro approccio basato sul tracciante ci ha permesso di considerare le origini del malonato osservato.

Come mostrato in Fig. 4a, il malonato derivato da ROS derivante dall’ossalacetato che era stato formato direttamente dal piruvato dall’attività PC utilizzando il glucosio come fonte di nutrimento sarebbe previsto per essere etichettato nelle posizioni C1 e C2. Nella situazione alternativa in cui l’attività PDH converte il piruvato in acetil-coA all’ingresso nel ciclo di Krebs, la conversione mediata dai ROS dell’ossalacetato risultante in malonato dovrebbe dare origine a due prodotti con etichetta nella posizione C1 o nella posizione C1 e C2 in un rapporto 1:1 perché il ciclo di Krebs passa attraverso succinato e fumarato simmetrici (vedi anche Fig. 1).

Figura 4b mostra una fetta rappresentativa 1D da spettri HSQC derivanti da 24 h BaP trattati con glucosio cellule etichettate e dimostra chiaramente farmaco indotta generazione di un segnale forte malonato. Negli spettri HSQC corrispondenti derivanti da 24 h BaP-trattato cellule etichettate con glucosio, abbiamo osservato un chiaro doppietto (Fig. 4c mostrato come picchi rossi) con una scissione di 58 Hz, indicativo di un gruppo CH2 etichettato accoppiato a un carbonio acido carbossilico. Questa è una chiara indicazione di un C1, C2 (o C2, C3) – etichettato malonato con etichetta in uno solo dei due gruppi acido carbossilico. Malonato etichettato in tutte e tre le posizioni che potrebbero derivare da più passaggi attraverso il ciclo di Krebs ci si aspetterebbe di mostrare un tripletto al C2 nella dimensione 13C degli spettri HSQC, come almeno una certa percentuale sarebbe etichettato in entrambi i gruppi COO (AX2 modello di accoppiamento). Pertanto, l’assenza di un segnale centrale in HSQC è altamente indicativa del fatto che il malonato deriva dall’attività PC a monte. L’assenza di malonato derivato da più cicli di Krebs e l’attività PDH è supportata anche dal fatto che il malonato derivante da 24 h etichettatura delle cellule trattate con BaP con glucosio ha mostrato solo un singoletto (Fig. 4c mostrato come picco blu).

Al fine di dimostrare ulteriormente che il malonato farmaco-indotto è derivato a valle di attività PC, abbiamo acquisito 13C-1D-spettri in cui abbiamo potuto osservare le risonanze COO di malonato direttamente (Fig. 4d). Uno spettro di riferimento di 10 mM di acido malonico nello stesso tampone (pH 7) utilizzato per gli estratti cellulari ha confermato la frequenza della risonanza COO (Fig. 4d).

L’etichettatura mediata dalla PC dovrebbe produrre un doppietto a C1 (derivante dal malonato), mentre l’etichettatura mediata dal PDH dovrebbe dare una miscela 50:50 di un doppietto derivante dal malonato e un singoletto derivante dal malonato (Fig. 4a). Anche se rumoroso anche dopo 24 ore di acquisizione, gli spettri derivati hanno mostrato un chiaro doppietto senza segnale residuo nel mezzo (Fig. 4d), confermando che il prodotto di etichettatura PC-derivato è dominante. Da questo, concludiamo che il malonato è effettivamente derivato dalla conversione ROS-mediata di ossalacetato originato interamente o almeno prevalentemente dall’attività PC e non mostra alcun contributo da un possibile prodotto PDH anche dopo un periodo di etichettatura di 24 ore. Gli esperimenti di controllo che utilizzano la glutammina come fonte di carbonio hanno mostrato solo una minima incorporazione dell’etichetta nel malonato. Il malonato prodotto dal glucosio ha dimostrato di essere prevalentemente etichettato tramite PC. Insieme, questi due fatti suggeriscono fortemente che il malonato è prodotto prevalentemente dal glucosio attraverso la glicolisi e l’ingresso mediato dalla PC del piruvato nel ciclo TCA.

Evidenza dell’attività parallela del PDH

La tabella 1 confronta le costanti di accoppiamento 1 J CC e i modelli di intensità del multipletto visti nelle serie di dati etichettati a 3 e 24 ore. In entrambi i set di dati 3 e 24 h, l’etichettatura a C4 del glutammato è molto maggiore dell’etichettatura a C4 e la scissione vista a C4 indica l’accoppiamento a C5. Questo suggerisce fortemente che l’etichettatura mediata dal PDH è dominante per il glutammato in entrambi i punti temporali. Il citrato C2 è diviso da un grande accoppiamento a C1, ancora una volta suggerendo fortemente che PDH-mediata etichettatura è dominante. Questi modelli di etichettatura indicano una chiara dominanza dei prodotti PDH per il ramo destro del ciclo di Krebs, che porta dal citrato al glutammato.

Analisi computazionale dei multipletti

Le fette del 1H-13C-HSQC sono state anche analizzate quantitativamente simulando gli spettri 13C-NMR per una miscela di diversi isotopomeri utilizzando il software pyGamma dall’interno del software NMRLab. Per il glutammato, l’analisi multipletto ha confermato che l’etichettatura PDH-mediata era dominante sia a 3 che a 24 ore, indipendentemente dal trattamento BaP. Per l’aspartato, l’analisi del multipletto ha confermato che c’è stato uno spostamento dall’etichettatura PC-mediata a 3 h verso l’etichettatura PDH-mediata a 24 h. Gli spettri simulati sono mostrati nel file aggiuntivo 5: Figura S4, e la tabella 2 conferma i risultati qualitativi per l’aspartato e il glutammato.