Assemblaggio e annotazione del genoma della medusa

Qui presentiamo il primo assemblaggio de novo del genoma della medusa di Nomura (Nemopilema nomurai; Fig. 1b). Ne è risultato un genoma di 213 Mb composto da 255 scaffold e una lunghezza N50 di 2,71 Mb, contenente solo 1,48% lacune (file aggiuntivo 1: tabelle S2 e S3). L’assemblaggio ibrido Nemopilema è stato creato utilizzando una combinazione di tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga, composto da 38,2 Gb di Pacific Biosciences (PacBio) di sequenziamento in tempo reale a singola molecola (SMRT), insieme a 98,6 Gb di Illumina short-insert, mate-pair, e TruSeq sintetico a lettura lunga (file aggiuntivo 1: figure S3-S5; tabelle S4-S7). L’assemblaggio risultante mostra la più lunga continuità tra i genomi cnidari (Additional file 1: Tabella S9). Abbiamo predetto 18.962 geni codificanti proteine delle meduse combinando de novo (usando i trascrittomi della campana della medusa e del tessuto dei tentacoli) e metodi di predizione dei geni omologhi (file aggiuntivo 1: tabelle S10 e S11, file aggiuntivi 2 e 3). Questo processo ha recuperato il più alto numero di geni ortologhi a copia singola tra tutti gli assemblaggi di genomi di metazoi non-bilateriani pubblicati fino ad oggi (file aggiuntivo 1: tabella S12). Un totale del 21,07% del genoma della medusa è stato trovato costituito da elementi trasponibili, rispetto a quelli di Acropora digitifera (9,45%), Nematostella vectensis (33,63%), e Hydra vulgaris (42,87%) (File aggiuntivo 1: Tabella S13).

Abbiamo confrontato il genoma di Nemopilema con altri genomi di cnidari, compresi i genomi di Aurelia aurita e Clytia hemisphaerica recentemente pubblicati, tutti provenienti da taxa prevalentemente sessili, per rilevare la funzione unica di Scyphozoa (mobilità attiva), la struttura fisica (campana medusa), e la chimica (veleno). Abbiamo anche eseguito analisi del trascrittoma sia di Nemopilema nomurai che della medusa Sanderia malayensis attraverso tre tipi di tessuto della medusa e quattro stadi di sviluppo.

Analisi evolutiva della medusa

Per identificare i tratti evolutivi specifici delle meduse, abbiamo esaminato le espansioni e le contrazioni delle famiglie di geni attraverso un olozoo unicellulare e 13 metazoi utilizzando 18.458 famiglie di geni omologhi (vedi file aggiuntivo 1: sezione 4.1). Di queste, 10.434 sono state trovate in Nemopilema e 6764 sono state condivise da tutte e tre le classi di cnidari disponibili (Scyphozoa: Nemopilema nomurai e Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera e Nematostella vectensis; Fig. 2a). Una filogenesi costruita usando questi ortologhi ha rivelato un clade monofiletico cnidariano che diverge dal gambo metazoo prima dell’evoluzione dei bilateri (Fig. 2b; File aggiuntivo 1: Figura S7). Per determinare quanti geni sono apparsi in ogni era evolutiva nel genoma della medusa di Nomura, abbiamo anche valutato l’età evolutiva dei geni codificanti le proteine. Raggruppando i geni della medusa in tre grandi ere evolutive, abbiamo osservato che mentre la maggior parte (80%) dei geni sono antichi (più vecchio di 741 Mya), alcuni (~ 3%) sono di età intermedia (741-239 Mya), e alcuni (17%) sono giovani (239 Mya ad oggi; Fig. 2c; Additional file 1: Figura S10). È interessante notare che, normalizzando il numero di geni per l’età e la lunghezza dell’era evolutiva, suggerisce che il turnover dei geni è più alto vicino al tempo presente. In totale, il genoma Nemopilema conteneva 123 famiglie di geni espanse e 164 contratte rispetto all’antenato comune di Nemopilema e Aurelia (Fig. 2b; vedi file aggiuntivo 1: sezione 4.2). I termini di Gene Ontology (GO) relativi alla percezione sensoriale erano sottorappresentati nella stirpe Cnidaria rispetto ai Bilateria, riflettendo accuratamente il sistema sensoriale meno complesso degli cnidari (file aggiuntivo 1: tabelle S14 e S15). Tuttavia, il trasporto di neurotrasmettitori (GO:0006836, P = 6.01E- 10) è stato significativamente arricchito nel lignaggio Scyphozoa rispetto all’antenato comune di Scyphozoa e Hydrozoa (Additional file 1: Tabelle S16 e S17), probabilmente a causa dell’equilibrio e delle strutture visive, come lo statocyst e gli ocelli, che sono più elaborati nella medusa mobile che nei polipi sessili. Rispetto all’antenato comune di Nemopilema e Aurelia, Nemopilema ha mostrato famiglie di geni espanse associate ad attività metallopeptidasi (GO:0008237, P = 2.86E- 14; File aggiuntivo 1: Tabelle S18 e S19). Inoltre, abbiamo trovato 1589 famiglie di geni ortologhi che sono specifici per gli Scyphozoa. I test di arricchimento dei geni specifici degli Scyphozoa hanno mostrato i termini del trasporto di ioni di sodio, l’attività dei canali ionici e l’attività dei recettori dei neurotrasmettitori (Additional file 1: Tabella S20).

Contesto genomico e geni associati ai muscoli

Le meduse hanno due tipi di muscoli primari: le cellule epiteliomuscolari, che sono le cellule muscolari predominanti negli cnidari sessili, e le cellule muscolari striate situate nella campana della medusa che sono essenziali per il nuoto. Per comprendere l’evoluzione del nuoto attivo nelle meduse, abbiamo esaminato il loro bias di codone rispetto ad altri metazoi calcolando il contenuto di guanina e citosina nella terza posizione del codone (GC3) (File aggiuntivo 1: Figura S13). È stato suggerito che i geni con un alto livello di GC3 sono più adattabili agli stress esterni (ad esempio, i cambiamenti ambientali). Tra i primi 100 geni ad alto punteggio GC3 biased, la regolazione della contrazione muscolare, e le vie di segnalazione dei neuropeptidi, i termini GO erano specifici per Nemopilema (file aggiuntivo 4: Tabelle S25 e S26). Il calcio svolge un ruolo chiave nella contrazione dei muscoli striati nelle meduse, e la via di segnalazione del calcio (GO:0004020, P = 5.60E- 10) ha mostrato un alto livello di GC3 bias specifici per Nemopilema. Nemopilema e Aurelia top 500 geni GC3 sono stati arricchiti in termini GO associati con omeostasi (ad es, omeostasi chimica cellulare e trasporto di ioni di sodio), che ipotizziamo sia essenziale per l’attivazione delle contrazioni muscolari che alimentano la predazione mobile della medusa (file aggiuntivo 1: sezione 5.1; file aggiuntivo 4: tabelle S27 e S28).

Siccome gli cnidari sono stati segnalati per la mancanza di complessi di titina e troponina, che sono componenti critici dei muscoli striati bilateriani, è stato suggerito che i due cladi si sono evoluti indipendentemente muscoli striati. Un’indagine dei geni che codificano le proteine strutturali e di regolazione del muscolo negli cnidari ha mostrato un conservato macchinario contrattile eumetazoo core actina-miosina condiviso con i bilateri (Additional file 1: Tabella S32). Tuttavia, come altri cnidari, Nemopilema manca di complessi di titina e troponina, che sono componenti chiave dei muscoli striati dei bilateri. Inoltre, la γ-sintrofina, un componente del complesso distroglicano, era assente in Nemopilema, Aurelia e Hydra. Tuttavia, Nemopilema e Aurelia possiedono le proteine α/β-Dystrobrevin e α/ε-Sarcoglycan del costamere associate al distroglicano, indicando che diversi componenti del complesso del distroglicano sono stati persi dopo la scissione Scyphozoa-Hydrozoa. È stato suggerito che Hydra ha subito semplificazioni secondarie rispetto a Nematostella, che ha un maggior grado di specializzazione delle cellule muscolari. Rispetto a Hydra e Nematostella, Nemopilema e Aurelia mostrano una complessità intermedia di proteine muscolari strutturali e di regolazione tra Hydra e Nematostella.

Profilo del trascrittoma della campana e del tentacolo della medusa

La campana e i tentacoli della medusa sono morfologicamente distinti e svolgono funzioni fisiologiche discrete. Abbiamo generato trascrittomi di campane e tentacoli di Nemopilema e della più piccola Sanderia malayensis, che può essere coltivata in laboratorio, per valutare la regolazione dello sviluppo (file aggiuntivo 1: tabella S29). Test di arricchimento dei geni altamente espressi hanno mostrato che le categorie funzionali associate al muscolo (ad esempio, il complesso miosina muscolare e la morfogenesi del tessuto muscolare) sono stati arricchiti nella campana (Fig. 3a; file aggiuntivo 5: tabelle S30-S33). Le miosine comprendono una superfamiglia di proteine motorie e svolgono un ruolo critico nella contrazione muscolare e sono coinvolte in una vasta gamma di processi di motilità negli Eucarioti. Criticamente, le proteine della famiglia Myosin II, che si trovano nelle cellule del tessuto muscolare striato e del tessuto muscolare liscio, sono responsabili della produzione della contrazione nelle cellule muscolari. Gli Cnidari possiedono sia cellule epiteliomuscolari che cellule muscolari striate. Il muscolo striato è una componente critica del subumbrella della campana della medusa, dove le sue contrazioni veloci alimentano il nuoto unico basato sulla propulsione della medusa. Abbiamo scoperto che la catena pesante della miosina di tipo II (MYH) e la catena leggera della miosina (MYL) sono altamente espresse nella campana e sono strettamente associate alle cellule muscolari striate e lisce. È interessante notare che Nemopilema e Aurelia hanno mostrato il maggior numero di copie di geni MYH e MYL tra i metazoi non-bilateri (Fig. 3c; Additional file 1: Figure S14-S17; Tabelle S38-40), e sei dei sette geni MYH e 12 dei 21 geni MYL in Nemopilema hanno mostrato una maggiore espressione nella campana che i tentacoli con molto alto ~ 8.8 e ~ 17 volte aumento in media, rispettivamente (Fig. 3d). Questi risultati suggeriscono che le combinazioni di espansione del numero di copie delle famiglie di geni della miosina di tipo II e l’alta espressione dei geni associati al muscolo hanno confermato che i muscoli nella campana della medusa sono un importante determinante della motilità della medusa.

Conversamente, le analisi di espressione genica dei tentacoli rivelato alti livelli di espressione RNA di neurotrasmettitore-associati categorie funzionali (complesso del canale ionico, postsinapsi, e l’attività del recettore del neurotrasmettitore; Fig. 3b; File aggiuntivo 5: Tabelle S34-S37); coerente con l’anatomia dei tentacoli delle meduse, che contengono le cellule sensoriali e un plesso sciolto della sottopopolazione neuronale alla base dell’ectoderma.

Modellazione del corpo nella medusa

C’è stato molto dibattito che circonda l’evoluzione precoce della modellazione del corpo nell’antenato comune dei metazoi, in particolare per quanto riguarda l’origine e l’espansione delle famiglie geniche Hox e Wnt. In totale, 83 omeodomini sono stati trovati in Nemopilema, mentre 82, 41, 120, e 148 omeodomini sono stati trovati da Aurelia, Hydra, Acropora, e Nematostella, rispettivamente (file aggiuntivo 1: Tabella S41). Cinque degli otto geni Hox in Nemopilema sono di tipo posteriore che sono associati con lo sviluppo dell’asse aborale e raggruppati con i geni Hox posteriori di Nematostella, HOXE e HOXF (file aggiuntivo 1: figure S18-S20). Aurelia ha sei geni Hox di tipo posteriore, ma non ha il tipo HOXB, C, e D (HOX2 negli esseri umani). Anche se assente in Hydra e Acropora, le analisi di sintenia dei geni ParaHox in Nemopilema mostrano che il gene XLOX/CDX si trova immediatamente a valle di GSX nello stesso orientamento tandem di quelli in Nematostella, suggerendo che XLOX/CDX era presente nell’antenato comune cnidari e successivamente perso in alcuni lignaggi (file aggiuntivo 1: Figura S21). I geni legati a Hox, EVX e EMX, sono presenti anche in Nemopilema e Aurelia, sebbene siano assenti in Hydra. Data la grande quantità di diversità ancestrale nei geni Wnt, è stato proposto che la segnalazione Wnt abbia controllato lo sviluppo del piano corporeo nei primi metazoi. Nemopilema possiede 13 ortologhi Wnt che rappresentano 10 sottofamiglie Wnt (Additional file1: Figura S22; Tabella S42). Wnt9 è assente da tutti gli cnidari, probabilmente rappresentando perdite nell’antenato comune cnidari. Cnidari hanno subito dinamiche lineage-specifiche duplicazioni sottofamiglia Wnt, come Wnt8 (Nematostella, Acropora, e Aurelia), Wnt10 (Hydra), e Wnt11, e Wnt16 (Nemopilema e Aurelia). È stato proposto che un cluster comune di geni Wnt (Wnt1-Wnt6-Wnt10) esisteva nell’ultimo antenato comune di artropodi e deuterostomi. Le nostre analisi dei genomi cnidari e bilateri hanno rivelato che Acropora possiede anche questo cluster, mentre Nemopilema, Aurelia e Hydra mancano di Wnt6, suggerendo la perdita del gene Wnt6 nell’antenato comune Medusozoa (Additional file 1: Figura S23). Nel complesso, le meduse hanno un numero di geni Hox e Wnt paragonabile a quello di altri cnidari, ma il repertorio dinamico di queste famiglie di geni suggerisce che gli cnidari si sono evoluti indipendentemente per adattare le loro caratteristiche fisiologiche e il loro ciclo di vita.

Transizione da polipo a medusa nelle meduse

La transizione da polipo a medusa è importante nelle meduse rispetto agli altri cnidari sessili. Per comprendere le basi genetiche della formazione della struttura medusa nelle meduse, abbiamo confrontato la regolazione trascrizionale tra cnidari e attraverso le fasi di sviluppo delle meduse (vedi file aggiuntivo 1: sezioni 7.1 e 7.2). Abbiamo assemblato i trascritti di Sanderia usando sei campioni di trascrittomi in comune (file aggiuntivo 1: tabella S43). I trascritti assemblati avevano una lunghezza totale di 61 Mb e sono risultati in 58.290 isoforme di trascrizione e 43.541 trascrizioni uniche, con un N50 di 2325 bp. In media, l’87% delle letture dell’RNA sono state allineate ai trascritti assemblati (Additional file 1: Tabella S44), indicando che l’assemblaggio del trascritto rappresentava la maggior parte delle letture sequenziate. Inoltre, la composizione dei domini proteici contenuti nei primi 20 ranghi era abbastanza simile tra Nemopilema e Sanderia (Additional file 1: Tabella S45). Per ottenere i geni differenzialmente espressi per ogni stadio, abbiamo confrontato ogni stadio con lo stadio precedente o successivo nel ciclo di vita della medusa. Lo stadio di polipo, che rappresenta uno stadio sessile nel ciclo di vita della medusa, ha mostrato termini arricchiti relativi all’attività dei canali ionici e al metabolismo energetico (regolazione del processo metabolico e processo metabolico degli aminoacidi; file aggiuntivo 1: tabella S46). L’alimentazione attiva nel polipo stimola la proliferazione asessuata in più polipi o la metamorfosi in strobila. Poiché gli antozoi non formano una medusa, lo stadio riproduttivo asessuato della strobila è uno stadio importante in cui studiare la metamorfosi da polipo a medusa. In questo stadio, i termini GO relativi ai processi biosintetici e metabolici dell’ammide erano altamente espressi rispetto allo stadio di polipo (file aggiuntivo 1: tabella S47). E’ stato riportato che i neuropeptidi RF-amide e LW-amide erano associati alla metamorfosi negli cnidari. Tuttavia, non abbiamo potuto confermare questa scoperta nei nostri confronti strobila e stadio ephyra. Nel nostro sistema, i modelli di espressione genica dei due stadi sono abbastanza simili. Nell’ephyra, lo stadio mobile rilasciato, i termini GO che coinvolgono il processo biosintetico e metabolico dell’ammide erano anche altamente espressi rispetto allo stadio della medusa fusa (file aggiuntivo 1: tabella S48). Nella medusa, la matrice extracellulare, l’attività metallopeptidasi e i termini di processo del sistema immunitario sono stati arricchiti (file aggiuntivo 1: Tabella S49), coerentemente con la fisiologia della loro campana, tentacoli e tipi di tessuto del braccio orale.

La metamorfosi da polipo a medusa è stata precedentemente dimostrata essere fortemente associata a CL390 e ai geni del recettore X retinoide (RXR) nella medusa Aurelia aurita. È interessante notare che CL390 non è stato trovato in Nemopilema o in altri cnidari pubblicati, suggerendo che potrebbe essere un gene induttore di strobilitazione Aurelia-specifico. Tuttavia, confermiamo che RXR è presente in Nemopilema e assente da cnidari senza una fase medusa (Additional file 1: Figura S24). La segnalazione dell’acido retinoico (RA) svolge un ruolo centrale durante la crescita e lo sviluppo dei vertebrati, dove regola la trascrizione interagendo con il recettore RA (RAR) legato agli elementi di risposta RA (RAREs) dei geni bersaglio vicini. Dei geni nella via di segnalazione RA, Nemopilema possiede ADH e RALDH enzimi che metabolizzano il retinolo a RA, e RXR e RAREs per attivare la trascrizione del gene bersaglio (Fig. 4a). Abbiamo scoperto 1630 regioni Nemopilema RARE con una distanza media di 13 Kbp al gene più vicino (Fig. 4b; Additional file 1: Tabelle S50 e S51). È interessante notare che quattro geni Hox posteriori di Nemopilema e due geni Hox di Aurelia si trovavano entro ± 10 Kbp da RAREs, che è unico tra i metazoi non-bilateriani (Fig. 4c; Additional file 1: Tabella S52). Insieme, questi risultati suggeriscono che la segnalazione dell’acido retinoico era presente nei primi metazoi per regolare i geni bersaglio con RXR e RAREs e che RXR e RAREs possono svolgere un ruolo critico per la metamorfosi da polipo a medusa.

Identificazione dei domini legati alle tossine nelle meduse

Le meduse producono miscele complesse di veleni proteici per catturare e difendere attivamente le prede. Abbiamo identificato abbondanti domini di tossine in Nemopilema rispetto ai set di geni di metazoi non-bilateriani nel database Tox-Prot. In totale, 67 su 136 domini di tossine si sono allineati ai metazoi non bilateriani; di questi 67 domini di tossine, 52 sono stati trovati nel Nemopilema (file aggiuntivo 1: tabella S53). Come previsto, il genoma del Nemopilema contiene il maggior numero di domini associati al veleno o alla tossina dei metazoi non bilateriani inclusi. Questi domini includono Reprolysin (M12B) famiglia zinco metalloproteasi (PF01421), fosfolipasi A2 (PF05826), e domini Prokineticin (PF06607) (Fig. 5). Inoltre, Nemopilema e Aurelia possiedono rispettivamente 8 e 11 domini ShK domain-like (PF01549), che sono i più abbondanti in queste specie rispetto ad altri non-bilateri. In particolare, le metalloproteasi di zinco della famiglia Reprolysin (M12B) sono enzimi che scindono i peptidi e comprendono la maggior parte delle endopeptidasi del veleno di serpente. Inoltre, è stato riportato che l’inibitore della serina proteasi e i domini ShK sono stati abbondantemente trovati nei trascrittomi sia della medusa palla di cannone (Stomolophus meleagris) che della medusa scatola (Chironex fleckeri), e la fosfolipasi A2 è un enzima ben caratterizzato legato alla tossina, che è fondamentale per la produzione di componenti del veleno, trovato nella classe Scyphozoa.