L’identificazione delle muffe filamentose nel laboratorio clinico di routine si basa ancora principalmente sull’esame microscopico delle colonie sporulanti. I funghi che mancano di sporocarpi o spore caratteristiche sono difficili da identificare (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). Nel presente studio sono stati analizzati 13 ceppi sterili o non diagnostici. Sulla base delle caratteristiche fenotipiche gli isolati sono stati identificati come specie Papulaspora a causa della formazione di ciuffi o strutture simili a bulbi (Vinod Mootha et al. 2012). Con i tentativi di indurre la sporulazione utilizzando vari substrati e condizioni di incubazione, alcuni ceppi hanno prodotto conidi minuti su brevi fialidi, ma ancora questi conidi non erano diagnosticamente utili e non potevano essere utilizzati per l’identificazione della specie.

Con l’analisi molecolare e filogenetica di sei loci, i ceppi sono risultati appartenere a tre nuove specie che sono descritte nel presente studio. Due specie si sono raggruppate con la specie tipo del genere Subramaniula, mentre una era sorella di due specie di Chaetomium descritte. Sia Subramaniula che Chaetomium sono membri della famiglia Chaetomiaceae (Sordariales). I membri di questa famiglia sono caratterizzati dalla formazione di ascospore in aschi deliquescenti all’interno di periteci più o meno ampiamente ornati (Whiteside 1961). L’identificazione fenotipica delle specie nelle Chaetomiaceae dipende principalmente dalla forma dei peli ascomatali, dalla pigmentazione e ornamentazione degli ascomi e dalla forma delle ascospore (Ames 1961; von Arx et al. 1984). Le tre specie descritte nel presente studio hanno esibito caratteristiche morfologiche insolite, non riuscendo a formare la riproduzione sessuale negli ascomi. Invece, erano presenti ammassi di cellule pigmentate scure a parete spessa. Non è chiaro se queste strutture rappresentino periteci immaturi (Davey et al. 2008). Nel quadro della nomenclatura singolare per i funghi (Taylor 2011), le specie sono qui descritte in generi sessuali sulla base della loro posizione filogenetica all’interno delle Chaetomiaceae.

Le due nuove specie raggruppate con Subramaniula provengono da fonti cliniche, soprattutto infezioni oculari o cutanee. Il genere coprofilo Subramaniula è attualmente conosciuto da due specie che sono state trasferite da Achaetomium, cioè S. irregularis e la specie tipo generica, S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). Il genere Subramaniula è caratterizzato da ascomi pallidi glabri con ampie aperture apicali (Fig. 8), senza una morfologia asessuata conosciuta. Cannon (1986) ha riportato “Alcune ife con catene di cellule considerevolmente gonfie, che producono corpi globosi o ellissoidali a parete sottile fino a 8 μm di diametro, ma potrebbero non funzionare come propaguli”. Alcuni autori hanno suggerito che questi corpi potrebbero essere legati allo stato asessuato di questo fungo (Pastirčák e Pastirčáková 2009). All’esame del ceppo ex-tipo di S. thielavioides (CBS 122.78), abbiamo rilevato catene di cellule gonfie, ma non sono stati visti corpi a parete sottile. Rispetto alle nostre due nuove specie di Subramaniula in cui sono stati osservati conidi, è improbabile che queste strutture siano i conidi, ma potrebbero agire come propaguli di sopravvivenza. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) è descritta come morfologicamente simile a S. thielavioides con alcune differenze nella forma e dimensione delle ascospore e nella pigmentazione degli ascomata, ma non è disponibile alcuna cultura vivente per questa specie (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides (CBS 122.78). Colonie dopo 1 settimana di incubazione su: a-b MEA dritto e rovescio; c OA; d Ascomata; e Ascomata wall; f-h Ascospores. – Barre della scala = 10 μm

Subramaniula thielavioides è stata isolata da un campione di letame in India, mentre S. irregularis è nota solo dal suolo in Sud Africa (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Finora nessuna infezione umana è stata attribuita a Subramaniula. Tuttavia, Cannon (1986) ha riportato l’isolamento di S. thielavioides da un’unghia umana e, curiosamente, ha riferito: “I micologi medici dovrebbero essere consapevoli della sua esistenza”. Con le due nuove specie cliniche descritte, il genere Subramaniula ha confermato di avere un potenziale come genere opportunistico che può causare infezioni della pelle, degli occhi e delle unghie. Un ceppo non identificato da un’ulcera corneale pubblicato da Vinod Mootha et al. (2012), CBS 123294, è descritto nel presente studio come una nuova specie Subramaniula asteroides. Il ceppo è stato recuperato da un paziente che indossava una lente a contatto e che si era ferito con un filo metallico mentre lavorava in una scuderia di cavalli. Il ceppo dH 21571 riguardava una cheratite emersa dopo un trauma oculare con una foglia appuntita in un campo agricolo dell’India tropicale. Altri due ceppi provenienti dagli Stati Uniti erano anch’essi derivati da ulcere corneali. Altri due ceppi provenienti da infezioni oculari in Spagna corrispondevano a S. asteroides; CNM-CM 4314 è stato isolato dall’essudato corneale di un paziente maschio di 27 anni, CNM-CM 7482 ha avuto origine da un’endoftalmite di un paziente immunosoppresso di 47 anni; sono state osservate ife nell’umor vitreo e il paziente ha perso l’occhio. Subramaniula asteroides sembra quindi avere una forte associazione con le infezioni oculari traumatiche. Nel corso di questo studio un’altra sequenza derivata da un isolato (UTHSC 03-1315) dalla pelle di un paziente dell’Arabia Saudita è stata anche identificata come S. asteroides. L’unico isolato ambientale di S. asteroides proveniva anch’esso dall’Arabia Saudita, vale a dire dal suolo sabbioso del deserto sotto l’impatto di idrocarburi. È stato recuperato mediante arricchimento con toluene (Zhao et al. 2010), un metodo progettato per l’isolamento di funghi che crescono in condizioni tossiche.

Subramaniula obscura è descritto nel presente documento per un singolo ceppo da un uomo kuwaitiano di 53 anni presente con un’infezione all’alluce. Il ceppo è stato inizialmente identificato come Chaetomium cuniculorum. Abbiamo scoperto che i ceppi di C. cuniculorum sono filogeneticamente correlati a S. obscura, in quanto entrambi sono stati trovati in un unico clade supportato basato sia sull’analisi dei geni ribosomiali (ML-BS/PP, 84 %/1.0) che sull’analisi multilocus dei geni codificanti le proteine (ML-BS/PP, 100 %/0.99) (Fig. 2). Con il sequenziamento ITS e utilizzando un numero limitato di taxa, la separazione delle due specie potrebbe effettivamente essere difficile. La sequenza ITS del ceppo ex-tipo di S. obscura, CBS 132916, ha mostrato il 97% di somiglianza con gli isolati di C. cuniculorum. Si pensa che quest’ultima specie sia presente soprattutto sullo sterco e circa la metà dei ceppi di C. cuniculorum mantenuti nella collezione di colture della CBS provengono dallo sterco di animali erbivori. La somiglianza ITS di S. obscura con S. thielavioides è del 99,4%, ma i geni che codificano le proteine sono costantemente diversi e quindi la descrizione della nuova specie in Subramaniula è garantita.

La macro e micro morfologia di Subramaniula obscura è simile a quella di S. asteroides, tranne per il fatto che le cellule che formano i ciuffi di S. obscura sono più brunastre e arrotondate, e le ife sono più spesse e con protrusioni simili a verruche. La temperatura minima di crescita per entrambe le specie e per S. thielavioides è di 6 °C, e tutte sono cresciute molto bene sopra i 40 °C indicando la termotolleranza delle specie Subramaniula. La crescita ottimale è avvenuta tra i 33 e i 36 °C, e la sopravvivenza costante a 37 °C denota la capacità di crescere alla temperatura del corpo umano come fattore di virulenza (Revankar e Sutton 2010).

L’identificazione del ceppo Chaetomium anamorphosum CBS 137114 come nuova specie, recuperata da una peritonite umana, è stata fatta inizialmente tramite confronto morfologico con le specie Papulaspora descritte. Questo ceppo ha mostrato una certa somiglianza con Papulaspora nishigaharanas per la formazione di aggregati di cellule di colore marrone a parete spessa, così come per la produzione di fialoconidi (Watanabe 1991). Il confronto delle sequenze di ITS e della regione D1/D2 del gene 28S rRNA in GenBank non ha rivelato omologia con nessuna specie conosciuta sequenziata. Con l’approccio filogenetico molecolare siamo stati in grado di risolvere la tassonomia di questo isolato come un parente stretto delle specie ascosporanti Chaetomium irregulare e C. fusisporum (Figg. 1, 2, e 9). La specie appena identificata differiva da C. irregulare e C. fusisporum, non solo nella morfologia ma anche nella temperatura di crescita. La temperatura ottimale di crescita di C. anamorphosum era di 33-36 °C e la crescita è stata ancora osservata a 40 °C, mentre per C. irregulare la temperatura ottimale era di 30 °C e non era in grado di crescere o cresceva poco a 40 °C. Chaetomium irregulare è stato trasferito al genere Achaetomium da Rodríguez et al. (2004). Tuttavia, se confrontato con il tipo generico Achaetomium globosum, è stato trovato distante e il nome Achaetomium irregulare è ridondante. La tassonomia e la nomenclatura del clade che contiene la nuova specie e altri Chaetomium spp. come parafiletico a Subramaniula non sono chiare a causa della distanza relativamente grande dalla specie tipo generica, C. globosum. Inoltre, la morfologia degli ascomi, dei peli ascomatali, se presenti, e delle ascospore delle specie di questo clade differisce da quella di C. globosum. I generi Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula e Achaetomiella erano morfologicamente simili con solo poche differenze nella presenza e assenza di peli ascomatali, nella parete dell’ascoma, nel colore delle ascospore e nel tasso di crescita (Cannon 1986). Questi caratteri sono diventati in gran parte irrilevanti grazie alla disponibilità di dati molecolari. In attesa di una revisione tassonomica di Chaetomium, manteniamo l’attuale classificazione del cluster all’interno di questo genere, riconoscendo Subramaniula come un genere annidato in Chaetomium.

Chaetomium irregulare (CBS 446.66). Colonie su MEA: a Una settimana b Quattro settimane di incubazione; c Asci sulla superficie di agar OA; d Ascomata; e Parete di ascomata; f-g Asci; h. Ascospore. – Scale bars = 10 μm

Nonostante il gran numero di specie descritte in Chaetomium e parenti, poco si sa sulla loro tassonomia molecolare e solo poche specie sono state sequenziate e sono disponibili nei database pubblici (Wang et al. 2014). La maggior parte degli studi precedenti erano limitati a specie rare, e la filogenesi delle specie di Chaetomium più ubiquitarie rimane irrisolta (Asgari e Zare 2011; Lee e Hanlin 1999; Wang et al. 2014). Recentemente, tre nuove specie del gruppo C. indicum sono state descritte sulla base dell’analisi molecolare di quattro geni (Wang et al. 2014). Un altro studio molecolare di Chaetomium è stato quello di Asgari e Zare (2011) in Iran utilizzando l’analisi filogenetica di tre geni che ha portato alla delimitazione di sei nuove specie. Due di queste hanno mostrato morfologie asessuate simili a quelle formate da Chaetomium anamorphosum e da entrambe le specie Subramaniula descritte nel presente lavoro. Chaetomium rectangulare Asgari e Zare (2011) appartiene al gruppo di C. globosum caratterizzato da morfologie asessuate con fialidi e conidi molto simili a quelli della nostra nuova specie. Questo potrebbe indicare che le nuove specie hanno in qualche modo perso la loro capacità di formare la fruttificazione sessuale e l’hanno sostituita con un tipo di sporulazione asessuata. Il sequenziamento del locus MAT che regola la riproduzione sessuale potrebbe indicare se i morfemi sessuali in queste specie sono assenti o soppressi.

Lo sterco animale, la materia vegetale in decomposizione e il suolo sono habitat naturali noti per le specie Chaetomium, Subramaniula e Papulaspora. De Hoog et al. (2013b) hanno notato che il genere Madurella è annidato all’interno di Chaetomium e che molte specie nelle Chaetomiaceae combinano l’associazione allo sterco con condizioni climatiche aride. Aggiungendo a Chaetomium le specie non ascosporanti precedentemente non identificate, il ruolo di questo genere nelle malattie umane e animali è aumentato notevolmente. Infezioni da Chaetomium e infezioni da specie raggruppate nell’albero filogenetico di Chaetomium, come Chaetomidium e Thielavia, sono state riportate da pelle, capelli e unghie (Hubka et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Inoltre, diverse specie delle Chaetomiaceae sono state segnalate come causa di gravi infezioni opportunistiche in pazienti immunocompromessi (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Diversi casi di peritonite simili ai nostri di C. anamorphosum sono stati riportati in individui immunocompromessi che avevano acquisito l’infezione durante la dialisi peritoneale. Febré et al. (1999) hanno isolato C. globosum da bottiglie di liquido di dialisi; la peritonite è stata riportata da Baer et al. (2013). Un caso interessante pubblicato da Issa et al. (2013) riguardava una peritonite in una donna immunocompetente di Damam, Arabia Saudita, causata da una specie sconosciuta di Chaetomium. Apparentemente anche gli individui immunocompetenti sono a rischio di infezioni profonde da Chaetomium o funghi correlati. Come esempio, un caso di feofomicosi cerebrale fatale causata da Thielavia subthermophila è stato riportato in individui immunocompetenti (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum, e C. strumarium sono ora considerati come specie neurotropiche che causano infezioni gravi e pericolose per la vita (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Sembra che i membri delle Chaetomiaceae abbiano effettivamente un potenziale clinico sottovalutato, e una rivalutazione del ruolo del genere nella patologia umana è urgente. L’habitat naturale di molte specie in climi aridi e la loro sopravvivenza alle alte temperature probabilmente migliorano la loro sopravvivenza nei tessuti dei mammiferi. La capacità di C. anamorphosum di crescere in modo ottimale a 36 °C, in contrasto con C. irregulare, è un buon esempio. Le specie sono in grado di rompere la zona di esclusione termica del corpo umano e se c’è immunosoppressione o altri problemi immunologici i funghi possono emergere come potenziali patogeni umani (Casadevall 2012).

A causa delle difficoltà di identificazione sulla base di criteri fenotipici, alcuni vecchi casi di specie Chaetomium o Subramaniula potrebbero essere stati erroneamente ignorati o riportati come casi di infezione da Madurella o Papulaspora (Mohd-Tahir et al. 2012). I nostri studi dimostrano chiaramente che le infezioni traumatiche e opportunistiche da specie simili al chaetomium spesso producono ceppi non o scarsamente sporigeni in coltura (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). La descrizione di questi ceppi come entità tassonomiche separate nel genere è significativa sia dal punto di vista clinico che epidemiologico. Inoltre, gli studi di suscettibilità antifungina sono scarsi e i protocolli di trattamento sono urgentemente necessari.