Abstract

Il metabolismo cellulare dipende dalla concentrazione appropriata di fosfato inorganico (Pi) intracellulare. I geni Pi starvation-responsive sembrano essere coinvolti in molteplici percorsi metabolici, implicando un complesso sistema di regolazione Pi nei microrganismi e nelle piante. Un gruppo di enzimi è necessario per l’assorbimento e il mantenimento di adeguati livelli di fosfato, che viene rilasciato da esteri e anidridi di fosfato. Il sistema della fosfatasi è particolarmente adatto per lo studio dei meccanismi di regolazione perché l’attività della fosfatasi è facilmente misurata con metodi specifici e la differenza tra i livelli repressi e derepressi dell’attività della fosfatasi è facilmente rilevabile. Questo articolo analizza il sistema delle fosfatasi proteiche indotte durante la fame di fosfati in diversi organismi.

1. Introduzione

La regolazione dei processi cellulari, come la differenziazione cellulare, la proliferazione, la morte cellulare, la mobilità, il metabolismo, la sopravvivenza e l’organizzazione del citoscheletro, in risposta ad alcuni stimoli è fondamentale per tutti gli aspetti della vita cellulare. La fosforilazione delle proteine è uno dei meccanismi più comuni utilizzati per regolare questi processi. I processi che sono controllati in modo reversibile dalla fosforilazione delle proteine richiedono sia una proteina chinasi che una proteina fosfatasi.

Tradizionalmente, le protein chinasi sono state studiate più intensamente delle protein fosfatasi a causa della visione precedente che le protein chinasi conferiscono una regolazione fine alla fosforilazione delle proteine, mentre le protein fosfatasi agiscono semplicemente per rimuovere i gruppi fosfato. Solo nell’ultimo decennio ci si è resi conto che anche le fosfatasi proteiche sono regolate da una varietà di meccanismi e non sono meno importanti delle protein chinasi per la fisiologia cellulare. Le fosfatasi proteiche sono in grado di idrolizzare i metaboliti del fosfomonoestere, liberando il fosfato inorganico (Pi) da questi substrati.

Il fosforo, sotto forma di fosfato inorganico (Pi), è uno dei macronutrienti più importanti per tutti gli organismi. Non è solo utilizzato nella biosintesi dei componenti cellulari, come ATP, acidi nucleici, fosfolipidi e proteine, ma è anche coinvolto in molte vie metaboliche, tra cui il trasferimento di energia, l’attivazione delle proteine e i processi metabolici di carbonio e aminoacidi. Grandi quantità di fosfato sono necessarie per la sopravvivenza delle cellule. Nelle piante, il Pi è essenziale per la crescita e lo sviluppo. Nei funghi, la via di trasduzione del segnale Pi regola l’espressione di molti geni sensibili al fosfato che sono coinvolti nello scavenging e nell’assorbimento del Pi da fonti extracellulari. Nei parassiti tripanosomatidi, il Pi influenza la loro capacità di crescere correttamente e colonizzare l’ospite invertebrato.

In sintesi, le fosfatasi e le chinasi proteiche sono necessarie per l’omeostasi del Pi durante l’acquisizione, lo stoccaggio, il rilascio e l’integrazione metabolica del Pi. Lo scopo di questo articolo è di riassumere la regolazione delle fosfatasi da parte del fosfato inorganico, con un’enfasi sul ruolo di questi enzimi nella biologia cellulare.

2. Controllo di feedback delle fosfatasi da parte del fosfato inorganico: Il percorso PHO

Saccharomyces cerevisiae ha diverse fosfatasi con diverse specificità, localizzazione cellulare e permeasi usate nell’assorbimento del Pi. L’insieme dei geni responsabili di queste attività sono coordinatamente repressi dalla concentrazione di Pi nel mezzo di crescita. L’acquisizione cellulare, lo stoccaggio, il rilascio e l’integrazione metabolica del Pi richiede la partecipazione di molti enzimi essenziali come le fosfatasi acide extracellulari (APasi), le fosfodiesterasi, i trasportatori di Pi, le chinasi di polifosfato, le fosfatasi alcaline (ALPasi) e le endopolifosfatasi. Le attività di questi enzimi sono intrinsecamente legate all’omeostasi del Pi, e sono soggette a regolazione attraverso la via di trasduzione del segnale del Pi (PHO) in risposta ai vari livelli di Pi.

In un modello corrente per la regolazione del PHO, il regolatore positivo (o fattore positivo) Pho4p, codificato dal gene PH04, è indispensabile per l’attivazione trascrizionale dei geni PHO attraverso la sua attività e posizione. In un ambiente ad alto contenuto di Pi, un complesso di chinasi ciclina-dipendente (CDK) composto da Pho80p e Pho85p inibisce la funzione di Pho4p mediante iperfosforilazione. Pho4p iperfosforilato rimane nel citoplasma e non è in grado di attivare la trascrizione dei geni PHO. Quando la concentrazione di Pi nel mezzo è sufficientemente bassa, Pho81p inibisce la funzione del complesso Pho80p-Pho85p, permettendo a Pho4p di trasferirsi nel nucleo e attivare la trascrizione dei geni PHO. Questi geni codificano per i trasportatori ad alta affinità Pho84p e Pho89p; le fosfatasi acide secrete Pho5p, Pho11p e Pho12p; altre proteine correlate che aumentano il recupero del Pi da fonti extracellulari.

Questo percorso PHO è stato descritto in diversi organismi come piante, batteri e funghi. Il sistema delle fosfatasi nel lievito

Inizialmente, è stato osservato che diversi geni fosfatasi sono modulati dalla concentrazione di Pi nel terreno di coltura; così, la via PHO è stata inizialmente caratterizzata da fosfatasi differenzialmente espresse

In S. cerevisiae, la trascrizione dei geni che codificano fosfatasi acide e alcaline e il trasportatore Pi è coordinatamente repressa e derepressa a seconda della concentrazione Pi nel terreno di coltura. La maggior parte delle fosfatasi sintetizzate in condizioni di limitazione del Pi sono localizzate a livello extracellulare o sono associate alla membrana plasmatica o alla parete cellulare.

I geni fosfatasi regolati dal Pi includono PHO5, che codifica per la frazione maggiore delle fosfatasi acide represse (rAPasi; pH ottimale 3-4; EC 3.1.3.2), e i suoi isozimi PHO10 e PHO11 . Queste tre rAPasi sono glicoproteine che si trovano nella parete cellulare o nello spazio periplasmatico. Sono responsabili dello scavenging del fosfato e lavorano insieme ai trasportatori ad alta affinità per acquisire fosfato quando la concentrazione di Pi nell’ambiente è bassa. La rAPasi codificata dal gene PHO5 è glicosilata durante la secrezione attraverso la membrana ed è localizzata nello spazio periplasmatico. Pho5p è responsabile del >90% dell’attività dell’APasi.

Poiché il prodotto del gene PHO5 costituisce la maggior parte delle fosfatasi acide, la regolazione di PHO5 è fondamentale per l’omeostasi del fosfato cellulare. Gli attivatori trascrizionali, Pho4p e Pho2p, sono necessari per generare la struttura attiva della cromatina nel promotore PHO5 e stimolare la trascrizione. Pho80p-Pho85p è un complesso di chinasi ciclina/ciclina-dipendente che fosforila Pho4p in più siti per regolare negativamente la funzione di Pho4p. Huang e O’Shea hanno effettuato uno screening quantitativo ed enzimatico di una collezione di delezioni di lievito, alla ricerca di nuovi mutanti difettosi nell’espressione di PHO5. Tra i mutanti costitutivi, i ceppi pho80 e pho85 hanno mostrato i livelli più elevati di attività fosfatasica Pho5 e di mRNA PHO5 in condizioni di fosfato elevato, coerentemente con il loro ruolo centrale nel percorso PHO. La perdita completa dell’alta attività chinasica (Pho80p-Pho85) risulta nella piena attivazione del fattore di trascrizione Pho4, portando alla piena espressione di PHO5.

Un’altra importante classe di fosfatasi in S. cerevisiae è quella delle fosfatasi alcaline (ALPasi; pH ottimale 8; EC 3.1.3.1). PHO8 codifica per una fosfatasi alcalina non specifica repressa (rALPase). È una glicoproteina localizzata nel vacuolo che scinde diversi substrati per recuperare il fosfato dai prodotti intracellulari. Pho8p è una proteina dimerica Mg2+/Zn2+-dipendente, simile all’ALPasi in Escherichia coli e nelle cellule dei mammiferi. Il prodotto enzimatico di PHO13 è una proteina monomerica ed è specifico per il p-nitrofenil fosfato (pNPP) e l’istidinil fosfato. Questo enzima è stato fortemente attivato da ioni Mg2+, con un pH ottimale di 8,2 e un’elevata attività specifica per il pNPP, con un valore medio di 3,6 × 10-5 M.

4. Lo stress da fosforo modula le fosfatasi acide nelle piante

Le fosfatasi acide (APasi) possono essere attive contro una vasta gamma di fosfati organici presenti nel suolo. Questi enzimi sono fosfoidrolasi monoestere orthophosphoric non specifiche (EC 3.1.3.2) che scindono il Pi dai siti di legame estere. Le fosfatasi vegetali secrete mantengono il 50% di attività in un ampio intervallo di pH (4,0-7,6), mantengono l’80% di attività in un ampio intervallo di temperatura (22°C-48°C) e sono stabili a temperature fino a 60°C, il che li rende candidati ideali per gli enzimi attivi del suolo.

Le apasi sono abbondanti nell’Arabidopsis e sono rappresentate da almeno quattro famiglie di geni. Una recente indagine sul genoma annotato dell’Arabidopsis ha identificato sequenze per 1 APasi di His, 4 APasi fosfatidiche, 10 APasi di proteine di stoccaggio vegetative e 29 APasi viola.

Negli ultimi anni, c’è stato un notevole interesse per le APasi viola (PAP). L’analisi comparativa della struttura delle PAP delle piante superiori e dei mammiferi ha permesso di identificare i motivi conservati di sequenza e strutturali in questo tipo di enzima di molte specie eucariotiche.

Biochimicamente, le PAP delle piante funzionano come proteine omodimeriche con una massa molecolare di ~55 kDa per monomero, mentre le PAP dei mammiferi sono tipicamente proteine monomeriche con una massa molecolare di ~35 kDa. Molte PAP sono glicoproteine che sono destinate alla via secretoria. Un PAP da Spirodela oligorrhiza è stato trovato per essere glicosilfosfatidilinositolo ancorato nella cellula. Strutturalmente, i PAP vegetali hanno due domini. Il dominio NH2 non ha funzione catalitica. Il dominio COOH ha il centro metallico ed è il dominio catalitico dell’enzima. Un altro PAP da Lupinus albus può contenere un terzo dominio, con una struttura simile a quella delle desaturasi degli steroli, al suo terminale carbossilico. Non è noto quanto siano comuni le ultime due forme di modifica posttraslazionale nelle PAP di altre specie. Le PAP sono metalloenzimi che hanno un complesso binucleare di ioni metallici nel suo sito attivo. Il loro caratteristico colore dal rosa al viola è dovuto a una transizione di trasferimento di carica da un residuo di tirosina che coordina uno ione ferrico. Questo enzima può idrolizzare gli esteri dell’acido fosforico e le anidridi.

I PAP sono stati isolati da Phaseolus vulgaris (fagiolo comune), Glycine max (soia), Lupinus albus (lupino bianco), Lycopersicon esculentum (pomodoro), Triticum aestivum (grano), Hordeum vulgare (orzo), Zea mais (mais) e Oryza sativa (riso).

La risposta delle piante alla fame di Pi può essere divisa in due categorie: la risposta specifica e la risposta generale. Le risposte specifiche promuovono un’efficiente mobilitazione e acquisizione di Pi dal terreno di crescita e dai depositi intracellulari. Le risposte generali permettono la sopravvivenza a lungo termine coordinando il metabolismo cellulare con la disponibilità di nutrienti e il potenziale di crescita. L’attuazione di queste strategie richiede cambiamenti nei profili di espressione di centinaia di geni, come dimostrato dalle analisi del trascrittoma di Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Durante la fame di Pi, le piante aumentano l’espressione della fosfatasi come risposta generale. La produzione di fosfatasi è legata alla carenza di Pi, ed è stata proposta una correlazione positiva tra la produzione di fosfatasi acida e la nutrizione Pi. Per esempio, piante come i lupini, che sono più efficienti nell’acquisire Pi dal suolo, producono significativamente più fosfatasi rispetto ai cereali.

Wu et al. hanno analizzato la regolazione delle fosfatasi proteiche in Arabidopsis e hanno scoperto che tre geni per PAP sono stati indotti dalla fame di Pi. Inoltre, il gene At1g25230 è stato indotto più di 2 volte, dimostrando che questo gene è sensibile alla fame di Pi.

Nel genoma del riso, un totale di 26 geni PAP putativi sono stati identificati, e la fame di Pi ha indotto l’espressione di 10 geni PAP del riso, suggerendo che questi svolgono ruoli importanti nell’acclimatazione del riso a condizioni di basso Pi.

In Lycopersicon esculentum (pomodoro), LePS2, è indotto dalla fame di Pi. Si nota che le fosfatasi LePS2 rappresentano le prime fosfatasi citoplasmatiche che sono componenti della risposta alla fame di Pi. Sospensione delle cellule di pomodoro in Pi-starved media ha portato ad un aumento dell’attività PAP-specifica di circa 4 volte, ma l’attività PAP-specifica è rimasto basso e costante in cellule mantenute in alto Pi media. L’aumento dell’attività PAP nella crescita delle cellule in mezzo Pi-starved dimostra che PAP potrebbe avere un ruolo nel migliorare la disponibilità e l’utilizzo di Pi e può essere fondamentale per la mobilitazione intracellulare Pi rilevando una mancanza di Pi nel pomodoro. Ectofosfatasi come sensori di Pi

La membrana plasmatica delle cellule può contenere enzimi i cui siti attivi sono rivolti verso il mezzo esterno piuttosto che verso il citoplasma. Le attività di questi enzimi, denominati ectoenzimi, possono essere misurate utilizzando cellule intatte. Ectofosfatasi ed ectochinasi sono stati rilevati in diversi microrganismi, tra cui protozoi, batteri e funghi.

Molti studi hanno dimostrato un ruolo delle ectofosfatasi nell’acquisizione di Pi per l’uso nella crescita di vari tipi di cellule. Nelle cellule di funghi (Fonsecae pedrosoi), l’esaurimento del Pi dal mezzo di coltura induce apparentemente l’espressione di diverse attività di ectofosfatasi. La coltivazione di questi funghi in assenza di Pi esogeno ha dimostrato di portare alla generazione di cellule fungine che esprimono un’attività ectofosfatasi 130 volte superiore a quella espressa dai funghi coltivati in presenza di Pi. Le cellule di tripanosomatidi hanno ectofosfatasi che forniscono Pi idrolizzando metaboliti fosfomonoestere. Ad esempio, in T. rangeli, una bassa concentrazione di Pi nel mezzo di crescita induce l’espressione di una diversa attività ectofosfatasi, suggerendo che questo enzima porta a idrolizza composti fosforilati presenti nel mezzo extracellulare. Questa idrolisi potrebbe contribuire all’acquisizione di Pi durante lo sviluppo di T. rangeli epimastigoti.

In condizioni di limitazione del Pi, i batteri fluorescenti Pseudomona esprimono un insieme di geni di fame di fosfato. Per esempio, almeno 56 proteine Pi starvation sono indotte nel ceppo P. putida KT2442 , e, nel ceppo P. fluorescens DF57, è stata riportata l’induzione di diversi geni Pi starvation.

In molti eucarioti, la famiglia di proteine nucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi (E-NPP) è direttamente responsabile dell’idrolisi del fosfato dai nucleotidi extracellulari. Da NPP1 a -3 si trovano in quasi tutti i tipi di tessuto umano, e questi enzimi contengono un dominio alcalino ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi di tipo 1. In S. cerevisiae, NPP1 e NPP2 sono upregolati attraverso la trascrizione regolata da Pi.

6. Osservazioni conclusive

Pi è un composto che limita la crescita in vari organismi quando la sua disponibilità è bassa in molti ecosistemi. L’induzione dell’attività delle fosfatasi in risposta alla fame di Pi è un fenomeno comune tra gli organismi che acquisiscono Pi dall’ambiente. Questi enzimi sono in grado di idrolizzare substrati fosforilati per fornire una fonte di Pi durante una carenza di nutrienti. In Saccharomyces cerevisiae, il segnale di fame di Pi innesca un aumento della produzione di almeno quattro tipi di fosfatasi: (1) le fosfatasi acide Pho5, Pho11, e Pho12, che sono localizzate nello spazio periplasmatico; (2) la fosfatasi alcalina Pho8, che è localizzata nel vacuolo; (3) la glicerolo fosfatasi Hor2; (4) la polifosfatasi putativa Phm5, che è localizzata nel vacuolo. Tutti questi enzimi possono contribuire ad aumentare i livelli di Pi libero. Tuttavia, altre funzioni potrebbero essere attribuite a questi enzimi.

Del Pozo et al. hanno purificato una fosfatasi acida, AtACP5, che è indotta dalla fame di Pi in Arabidopsis thaliana. Questo enzima presenta due attività, idrolisi dei substrati fosforilati e formazione di perossido. L’attività di fosfatasi riflette probabilmente un ruolo nella mobilitazione del Pi; l’attività di perossidazione suggerisce che AtACP5 potrebbe anche avere un ruolo nel metabolismo delle specie reattive dell’ossigeno.

Insieme, le fosfatasi indotte dalla fame di Pi svolgono un ruolo nell’adattamento di un organismo allo stress, anche se si possono trovare altri ruoli.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dato dal Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick e A. L. A. Dos-Santos hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.