Le interazioni biomolecolari sono fondamentali per la maggior parte dei processi cellulari, e l’identificazione dei principali componenti che interagiscono è solitamente il primo passo verso la comprensione dei meccanismi che governano le varie funzioni cellulari. Così, le analisi statistiche delle immagini che possono essere eseguite su immagini di microscopia a fluorescenza di cellule fisse o vive sono state applicate di routine per studi biofisici e biologici cellulari. Questi approcci misurano la frazione di particelle che interagiscono analizzando immagini di fluorescenza a due colori per pixel colocalizzati. Gli algoritmi di colocalizzazione hanno dimostrato di essere efficaci, anche se la gamma dinamica e la precisione di queste misure non è mai stata ben stabilita. Spatial image cross-correlation spectroscopy (ICCS), che cross-correla le fluttuazioni spaziali dell’intensità registrate nelle immagini da due canali di rilevamento simultaneamente, ha anche recentemente dimostrato di essere una misura efficace di colocalizzazione pure. Attraverso simulazioni, imaging di anticorpi fluorescenti adsorbiti su vetro e misure di cellule, dimostriamo che ICCS esegue molto meglio di algoritmi di colocalizzazione standard a densità moderate o elevate di particelle, che si incontrano spesso nei sistemi cellulari. Inoltre, è stato trovato che il rapporto di densità tra le due specie etichettate di interesse gioca un ruolo importante nella precisione dell’analisi di colocalizzazione. Applicando un confronto diretto e sistematico tra l’algoritmo di colocalizzazione standard della microscopia a fluorescenza e l’ICCS spaziale, mostriamo i regimi in cui ogni approccio è applicabile e, cosa più importante, dove non riescono a dare risultati accurati.