Az emberi résztvevők

A spanyolországi kísérleteket a Valenciai La Fe Egyetemi Kórház etikai bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta, és betartotta a Helsinki Nyilatkozat és további felülvizsgálatok alapelveit. A berlini kísérleteket a berlini Charité-Universitätsmedizin etikai bizottsága hagyta jóvá (EA4/012/05). Két kohorszot vizsgáltak: az egyik 65 egészséges felnőtt önkéntesből állt, a másik 16 Usher-szindrómás (II. típusú) betegből, akik az USH2A különböző csonka mutációit hordozták. Három beteg adatait kihagytuk a jelen vizsgálatból, mivel két betegnél korábban cukorbetegséget diagnosztizáltak, egy betegnél pedig karpális alagút szindrómában szenvedett, ami befolyásolhatja a pszichofizikai küszöbértékeket. A vizsgálatban résztvevőket kilenc, bőrre alkalmazott pszichofizikai tesztből álló elemmel vizsgálták. A vizsgálatban való részvétel előtt minden résztvevő írásbeli és szóbeli tájékoztatást kapott, és írásbeli beleegyezését adta. A vizsgálatban résztvevők egyike sem volt <20 éves. A következő résztvevői információkat dokumentálták: életkor, nem, kéztartás, hallókészülékek (hallókészülékek, cochleáris implantátumok), a siketség és vakság tüneteinek súlyossága és társbetegségek.

Az ember kvantitatív szenzoros vizsgálata

A pszichofizikai vizsgálatokat a Német Neuropátiás Fájdalom Kutatóhálózat44 kvantitatív szenzoros vizsgálatának standardizált vizsgálati protokollja szerint végezték. A különböző frekvenciájú rezgésérzékelési küszöbértékeket kétválasztásos próbával határozták meg1,2. Az eszköz egy lineáris piezoaktuátorból (Physik Instrumente, katalógusszám: P-602.1 L) állt, amelynek elmozdulásait egy erősítő/szabályozó (Physik Instrumente, katalógusszám: E-665) hajtja és vezérli. A jeleket a PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments) adatgyűjtő rendszerrel dolgoztuk fel. A rezgési inger 1,8 s hosszú volt, és az emelkedési és süllyedési idő az induláskor és az eltoláskor 500, illetve 600 ms volt, függetlenül a vizsgálati frekvenciától vagy az amplitúdótól. Az inger időtartama a bekapcsolási és az eltolási fázisok között 700 ms volt. A rezgési ingerek olyan készletét alkalmaztuk, amely logaritmikusan skálázódott 18 nm és 45 μm között. A 10 Hz-es és 125 Hz-es rezgésvizsgálatoknál a kiindulási amplitúdót 7,18 μm-re, illetve 2,84 μm-re állítottuk be. Az alkalmazott vizsgálati körülmények között nem mértük közvetlenül a szonda mozgását. Ez a piezoaktuátor nagy hűséget mutat, de az amplitúdó csillapodása elméletileg előfordulhat nagyobb amplitúdójú elmozdulásoknál az aktuátor maximális mozgási amplitúdójának (35 μm) közelében. Azonban minden résztvevőnél a pszichofizikai küszöbértékek jóval 35 µm alatt maradtak minden vizsgált frekvencia esetében (1c. ábra). Megjegyzendő, hogy pontosan ugyanazt a készüléket használták az egészséges kontrollok és az Usher-szindrómás résztvevők mérésére. A mechanikus rezgésingereket a körömágy és a kisujj első ízülete közötti bőrfelületre juttattuk. A szonda üvegből készült, 5 mm átmérőjű, lapos, kör alakú érintkezési felülettel és sárgaréz ellensúlyozással, amely biztosította, hogy minden résztvevőnél azonos mértékű tartási erőt alkalmazzanak. A domináns kéz kisujját két frekvencián (10 Hz és 125 Hz; 1,8 s időtartam) vizsgálták. A résztvevők egy gomb megnyomásával jelezték a vibrációs inger észlelését a két időablak egyikében. A protokoll egy fel-le elrendezésből állt, amely növelte vagy csökkentette az inger amplitúdóját (18 nm és 45 µm között), a feladat során elért sikerességi aránytól függően. Nyolc fel-le amplitúdófordulatot (összesen ~40-80 egyéni kísérletet ülésenként) végeztünk az észlelési küszöb körül, hogy létrehozzuk az egyes páciensek átlagos észlelési küszöbértékét. A piezoeszköz által vezérelt rezgési ingerek amplitúdóját a szonda elmozdulási amplitúdójának mikroszkóp alatti mérésével kalibráltuk lépcsőzetes feszültségfokozatokra.

A tapintásélesség vizsgálatát az ujjbegy (medián innerváció) térbeli felbontásának határainak tesztelésére is alkalmaztuk, egy két intervallumos, kényszerválasztásos, tapintási rácsorientációs teszt segítségével, egy tapintásélesség-kockával, amely hat oldalból állt, különböző szélességű rácsokkal (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 és 6,0 mm)1,2,3 . A résztvevők szemét bekötötték, és a kockát függőleges vagy vízszintes tájolásban az ujjbegyükhöz helyezték. Kettő le és egy fel eljárást alkalmaztak 10-15 rácsméretű fordulóponttal. A küszöbértékeket (71% helyes válasz) a 15 fordulópontból az utolsó 10 mediánjaként számították ki2. A mechanikai észlelési küszöbértékeket 23 vFh szálból álló standardizált készlet (Optihair3-Set) segítségével határoztuk meg, 0,25 és 265 mN közötti erővel. A vFh-kat növekvő sorrendben alkalmaztuk a kéz dorzális oldalán (radiális innerváció) 1 másodpercig, amíg a résztvevő nem érzékelt tapintási érzést. Ezután a sorrend megfordult addig a pontig, amíg a résztvevő nem érzékelt tapintási érzést. Az öt megfordítás átlagos erejét vettük küszöbértéknek. A mechanikai fájdalomküszöböt hét darab súlyozott tűszúrás-stimulátorral (MRC Systems) vizsgálták, amelyek csúcsa 0,25 mm-es volt, az erő pedig 8 és 512 mN között mozgott. Egy egyszerű lépcsőzetes módszert (egy felfelé és egy lefelé szabály) végeztünk, ahol a pácienseket megkérdeztük, hogy az inger élesnek érzékelik-e, ami a szúró fájdalom érzetét okozza. Az ingereket a kéz dorzális oldalára vFh észlelési feladatok után alkalmazták. A küszöbértéket öt megfordítás átlagából számították ki. A termikus meleg és hideg érzékelési küszöböket, valamint a meleg és hideg fájdalomküszöböket TSA II termoszenzoros analizátorral (MEDOC) vizsgáltuk. A termóda területe 9 cm2 volt, a határhőmérséklet 0 és 50 °C között volt, a hőmérsékletváltozás sebessége pedig 1 °C s-1 volt. A termódát az alkar középső részének voláris oldalára helyezték (medialis antebrachialis innerváció). Minden termikus tesztnél három egymást követő próbát végeztünk a következő sorrendben: hidegérzékelés, melegérzékelés, hidegfájdalom- és melegfájdalomküszöb. A vizsgálatban résztvevőket megkérték, hogy jelezzék, mikor kezdték el érezni a lehűlést, a felmelegedést, a hideg- és a melegfájdalmat. A küszöbértékek az egyes tesztek három próbájának átlaghőmérséklete volt.

Egerek

Minden kísérletet a berlini Állat etikai bizottság (Landesamt für Gesundheit und Soziales) hagyott jóvá, és az európai állatvédelmi törvényeknek megfelelően végezték. A CBA/CaJ háttérből származó, 10 és 30 hetes kor közötti hím és nőstény Ush2a-/- egereket és vad típusú alomtársakat (Ush2a+/+) használtunk11. Minden anatómiai és elektrofiziológiai kísérletet megközelítőleg azonos számú nőstény és hím egereken végeztünk. A rezgésdetektálási feladathoz csak nőstény egereket használtunk. Minden egeret 12 órás világos:12 órás sötét ciklusban tartottunk.

Egerek szöveti anatómiája és immunhisztokémia

A bőr immunhisztokémiájához az egereket 2-4 percig tartó CO2-inhalációval, majd nyaki dislokációval eutanáziáztuk, és a mancsok bőrszövetét felboncoltuk, a hipodermiszt, a szalagokat és a kapcsolódó izomszövetet eltávolítottuk. A bőrmintákat rovartűkkel kifeszítettük és 45 percig 4%-os paraformaldehidben (PFA) rögzítettük. A zselatinos vibratómmetszetek készítéséhez a szövetmintákat beágyazó formákba (Polysciences, T-8) helyeztük, meleg zselatinnal (20%, 0,1 M foszfát-pufferelt sóoldatban (PBS) oldva) töltöttük, és 4%-os PFA-ban egy éjszakán át 4 °C-on posztfixáltuk, mielőtt 120 µm-es metszeteket vágtunk vibratóm (Leica, VT100S) segítségével. Az egész alakos festéshez a bőrmintákat 2 órán át PFA-ban nyújtottuk, majd 24 órán át 4 °C-on 20% dimetilszulfoxidban és 80% metanolban posztfixáltuk. A vágás vagy a poszt-fixálás után a szövetmintákat háromszor mostuk PBS-ben (0,1 M), majd 72 órán át 4 °C-on inkubáltuk blokkoló oldatban és primer antitestekben. Ezután a mintákat háromszor mostuk PBS-ben, majd 24 órán át (4 °C-on) blokkoló oldatban hígított másodlagos antitestekkel inkubáltuk. A szöveteket ezután ismét háromszor mostuk, majd 2,2′-tiódietanol (TDE, Sigma-Aldrich) segítségével feldolgoztuk a szövetek tisztítására. A metszeteket 2 óránként növekvő koncentrációjú TDE-be helyeztük, 10%-tól 25%, 50% és 97%-ig, amelyben a mintákat tároltuk, majd tárgylemezre és fedőlemezre rögzítettük.

Az Ush2A-t célzó poliklonális antitesteket az Eurogentec állította elő nyúlban. Négy olyan antitestet hoztunk létre, amelyek az Ush2A N- és C-terminusán lévő különböző kötő epitópokhoz kötődnek (N-terminus: 1. antitest, CSPLYNDKPFRSGDNV és 2. antitest, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: 1. antitest, C+ADTRLPRSGTPMSIR és 2. antitest, CIRERPPLVPLQKRMT), és felhasználás előtt az antiszérákból tisztítottuk őket. Mind a négy antitestet együttesen (1:200) használtuk a festési protokollokhoz a csirke anti-NF200 (Millipore, 1:1 000), nyúl anti-S100 (Dako, 1:1 000) vagy tengerimalac anti-CK20 (Origene Tech, 1:200) egymás utáni festése során. A másodlagos antitestek a következők voltak: antinyúl Alexa Fluor 488 (Invitrogen,1:800), anticsirke Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), antiegér Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), antinyúl Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) és anti-tengerimalac Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Az egymásra helyezett z-stack képeket konfokális mikroszkóppal (Carl-Zeiss, katalógusszám: LSM700) készítettük a Zen2009 szoftver segítségével. Az NF200+ és S100+ idegrostokat ellátó Meissner-testeket és szőrtüszőket Fiji/ImageJ segítségével vizualizáltuk és számoltuk meg. Az ülőidegről készült elektronmikroszkópos felvételekhez az állatokat perfundálták, az ülőideget felboncolták, 4%-os PFA-ban és 2,5%-os glutaraldehidben fixálták, majd a Technovit 7100 gyantába (Heraeus Kulzer) történő beágyazás előtt ozmiumtetroxiddal kontrasztosították. Az ultravékony metszeteket 5600×-os nagyítással vettük fel. A myelinizált idegrostokat és a nem myelinizált rostokat a Fiji/ImageJ szoftver segítségével számoltuk és mértük.

Reprodukálhatóság

Minden immunhisztokémiai kísérletet és felvett képet több egérkohorszban, különböző napokon megismételtünk, és nem készültek olyan képek egyetlen egyedről sem, amelyek nem voltak reprodukálhatók. Az elektronmikroszkópos felvételek különböző alomtestekről készültek egyetlen kísérleti menetben.

Egerek bőr-ideg preparációja és szenzoros afferens felvételek

Az ex vivo bőr-ideg preparátum felhasználásával bőr-ideg felvételeket végeztünk. Az egereket 2-4 percig tartó CO2-inhalációval, majd nyaki dislokációval eutanáziáztuk. Három különböző preparátumot végeztünk külön kísérletekben, különböző mancsrészeket használva: a szőrös hátsó mancs bőrét ingerlő nervus saphenus21; a glabrous hátsó mancs bőrét ingerlő nervus tibialis21; és az elülső mancs glabrous bőrét ingerlő nervus medialis és nervus ulnaris20. Minden preparátum esetében a végtag szőrös bőrét leborotválták, majd a bőrt és az idegeket szabadon boncolták és a felvevő kamrába helyezték, ahol a felvétel minőségének javítása érdekében az izom-, csont- és ínszöveteket eltávolították a bőrről. A felvevő kamrát 32 °C-os szintetikus interstitialis folyadékkal perfundáltuk: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM nátrium-glükonát, 5,5 mM glükóz, 7,5 mM szacharóz és 10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etánszulfonsav (Hepes), pH 7,4. A felvevő kamrát a következőkkel perfundáltuk. A bőrt kitűzték és kifeszítették, hogy a bőr külső része stimuláló szondákkal stimulálható legyen. A perifériás ideget egy szomszédos, ásványi olajban lévő kamrába vezettük át, ahol finom szálakat téptünk ki az idegből, és ezüsthuzalos regisztráló elektródára helyeztük.

A bőr felszínének tompa üvegrúddal vagy tompa csipesszel történő mechanikai szondázásával azonosítottuk az egyes mechanoreceptorok receptív mezőit. A Neurolog erősítő analóg kimenetét a Powerlab 4/30 rendszer és a Labchart 7.1 szoftver (ADinstruments) segítségével szűrtük és digitalizáltuk. A Labchart 7.1 program Spike-hisztogram kiterjesztését használtuk az egyes egységek tüskéinek rendezésére. Elektromos ingereket (1 Hz, 50-500 ms hosszúságú négyzetes impulzusok) adtunk az egyes egységek receptív mezőinek, hogy megmérjük a vezetési sebességet, és lehetővé tegyük a C-rostok (sebesség <1,2 m s-1), Aδ-rostok (1,2-10 m s-1) vagy Aβ-rostok (>10 m s-1) osztályozását. A neuronok receptív mezőinek mechanikus stimulációját piezoaktuátor (Physik Instrumente, katalógusszám: P-841.60) és egy kétvégű Nanomotor (Kleindiek Nanotechnik, katalógusszám: MM-NM3108) segítségével végeztük, amelyhez egy erőmérő készülék (Kleindiek Nanotechnik, katalógusszám: PL-FMS-LS) csatlakozott. A kísérlet során a Powerlab rendszer és a Labchart szoftver segítségével egyidejűleg kalibrált erőméréseket végeztünk (bővített adatok 10. ábra).

Mivel a különböző száltípusok eltérő inger-hangolási tulajdonságokkal rendelkeznek, az egységtípus alapján különböző mechanikai ingerlési protokollokat használtunk. Az alacsony küszöbű Aβ-rostokat (RAM-ok és SAM-ok) és az Aδ-rostok D-hajszálait a piezoaktuátorral három rezgési ingerrel stimuláltuk (5 Hz, 25 Hz és 50 Hz, a soron belüli erőérzékelő által bevezetett torzítások kizárták a >50 Hz-es frekvenciák használatát) növekvő amplitúdóval hat lépésben (csúcs-csúcs amplitúdók ~6-65 mN; 20 ciklus lépésenként), és egy dinamikus ingerlési szekvencia négy ramp-and-hold hullámformával, változó szonda kitérési sebességgel (3 s időtartam; 0.075, 0,15, 0,45 és 1,5 mm s-1; átlagos amplitúdó 100 mN). Az Aβ-rost SAM-eket és RAM-okat a tüzelés jelenléte vagy hiánya alapján osztályoztuk a ramp-and-hold stimulus statikus fázisa alatt, a korábban leírtak szerint20,21. Az egyes egységeket ezenkívül öt statikus mechanikai inger sorozatával stimuláltuk, növekvő amplitúdójú ramp-and-hold hullámformákkal (3 s időtartam; ~10 mN és 260 mN között). Az alacsony küszöbű SAM-eket, a magas küszöbű Aδ-rostokat és a C-rostokat is stimuláltuk a nanomotor segítségével öt növekvő amplitúdójú ramp-and-hold ingerléssel20.

Egyetlen egység felvételek a Pacinianus afferensekből

A fibula körül elhelyezkedő Pacinianus testek mechanoszenzitivitásának felméréséhez a bőrt és az összes izmot eltávolítottuk az alsó lábszárról, és az interosseus ideget az interosseus membrántól szabadon vágtuk. Ezt követően a fibulát és a sípcsontot, amelyek egereknél a disztális felük mentén összenőttek, az interosseus ideggel együtt eltávolítottuk az állatból, és egy testre szabott szervfürdőkamrába helyeztük őket, ahol egy testre szabott mini-vice segítségével szereltük fel őket. A teljes boncolási eljárást jéghideg boncolási pufferben végeztük, amely 108 mM N-metil-d-glükamint, 20 mM Hepes-t, 3,5 mM KCl-t, 10 mM MgSO4-t, 26 mM NaHCO3-t, 1,7 mM NaH2PO4-t, 9,5 mM nátrium-glükonátot, 5,5 mM glükózt, 18,5 mM szacharózt és 0,5 mM CaCl2-t (NaOH-val pH 7,4-re beállítva) tartalmazott. A 10 perces regenerációs időszakot követően a preparátumot oxigenizált felvételi pufferrel perfundáltuk (35 °C), amely 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM nátrium-glükonát, 5,5 mM glükóz, 7,5 mM szacharóz és 1,5 mM CaCl2 (NaOH-val pH 7,4-re beállítva), és az interossealis ideg proximális végét egy olajjal töltött regisztráló kamrába helyeztük át egy kis lyukon (~1 mm átmérő) keresztül, amely a szervfürdőkamrát a szomszédos regisztráló kamrával kötötte össze. A perineurium eltávolítása után az akciós potenciálok rögzítéséhez az egyes szálakat felszabadítottuk és a regisztráló elektródához csatlakoztattuk. A felvételeket a Neurolog rendszerrel (Digitimer Ltd., katalógusszámok: NL100AK és NL104A) és a LabChart 7.1 (AD Instruments) által vezérelt PowerLab 4SP-vel végeztük. A mechanikai aktivációs küszöbérték és a Pacinianus afferensek frekvenciahangolásának meghatározásához szinuszos mechanikai ingerek sorozatát (időtartam 1 s; lineárisan növekvő amplitúdó damp/dt = 30 µm s-1; maximális amplitúdó 30 µm) növekvő frekvenciával (40-480 Hz) alkalmaztuk a fibula disztális végére egy fémrúddal (csúcsátmérő 1 mm), amelyet egy piezoaktuátorhoz (Physik Instrumente GmbH, katalógusszám. P-840.2).

Egerek rezgésérzékelési tanulási feladata

Először a fejtámasz beültetéséhez az egereket izofluránnal (1,5-2% O2-ben) altattuk, és metamizolt (200 mg/testsúlykilogrammonként) fecskendeztünk be szubkután. A koponyára ragasztóval (UHU dent) és fogászati cementtel (Paladur) egy könnyűfémtartót ültettek. Az egerek hőmérsékletét rektális szondával figyeltük, és melegítőpárna segítségével 37 °C-on tartottuk. Az egereket ezután az otthoni ketrecükbe helyezték, az ivóvízbe metamizolt (200 mg ml-1) kevertek. A beültetett egereket 3-5 nappal a műtét után hozzászoktatták a fejtartáshoz. Az egereket a viselkedési beállításban fokozatosan hozzászoktattuk a fejrögzítéshez. Ezután, 1 ddel a vízkorlátozás megkezdése után az egerek két egymást követő napon két párosítási ülésen estek át.

A párosítási ülések során (30-45 perces időtartam) vízjutalmat adtunk a vízkiöntőből a vibrációs inger (3 s időtartam, 5 Hz, 60 mN) bemutatásával párosítva az elülső mancs kopasz bőrére az inger és a jutalom közötti asszociáció kialakítása érdekében. A vibrációs inger a mancsot egy egyedi, 2 mm2 -es, párnázott üvegrúddal adtuk, amely egy piezoaktuátorhoz (PICMA a Physik Instrumente-től, katalógusszám: PL127.11) csatlakozott. A feszültség-erő kapcsolat kalibrálása egy erőmérő rendszer (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) segítségével történt, amely minden kísérlet után mérte a piezo eszköz által alkalmazott szinuszos erőprofilt. Az alkalmazott hajlító piezoaktuátor más halmozott piezo-rendszerekhez képest némi harmonikus zajt adhatott hozzá. A piezo kalibrálása azonban minden egyes kísérletben biztosította, hogy az Ush2a-hiányos egerek jelentős hiányosságai a tapintás érzékelésében valószínűleg nem technikai artefaktumok voltak.

A párosítás után megkezdődtek a napi tréningek, amelyek során az egerek kis vízjutalmat (4-7 μl) kaptak a kiöntőből, ha az inger kezdetén egy időablakban (3,5 s) helyesen nyaltak. A fogási próbák, amikor nem mutattak be ingereket, és a nyalásokat hamis riasztásként számolták, az összes próba 50%-aként váltakoztak. A próbákat a korábban leírtak szerint10 semmilyen külső esemény vagy inger nem jelezte, és randomizált időintervallumokban, 3 és 30 s között adták be őket. Ha az egerek az inger kezdete előtti 2 s-os ablakban nyaltak, az inger-víz jutalom asszociáció elősegítése érdekében 3 és 30 s közötti késleltetést alkalmaztunk. Egy edzés körülbelül 60 próbából állt (30× inger + 30× fogás). A találatok és a téves riasztások arányát összehasonlítottuk, hogy értékeljük a teljesítményt a tréningek során. Annak tesztelésére, hogy az egerek az elülső mancs rezgési ingerére válaszul nyalogatnak-e, a tréning végén egy olyan ülést végeztünk, amelyben az ingerlő eszközt 3-5 mm-rel a mancs alá mozgattuk, így nem történt bőrkontaktus. A következő kísérleti napokon, miután az egerek sikeresen megtanulták a feladatot, különböző amplitúdókkal és frekvenciákkal adtunk rezgési ingereket. Az 5 Hz-es rezgés esetében 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN és 6 mN erővel stimuláltuk az elülső mancsot, két különböző amplitúdójú, fogási kísérletekkel váltakozó erővel az egyes napok során. Például a 48 mN és 24 mN-os ingereket és a fogási próbákat egy ülés során váltogatták, amely körülbelül 100 próbából állt (33× 48 mN-os inger + 33× 24 mN-os inger + 34× fogás). A 6 mN-os ingereket két ülésen keresztül teszteltük. A 25 Hz-es és 125 Hz-es rezgés esetében az azonos frekvenciájú 60-mN-os és 12-mN-os erők és a fogási próbák ugyanilyen módon váltakoztak két vizsgálati ülésen keresztül.

Egerek páros impulzusgátlási viselkedési vizsgálata

Az egerek riasztó válaszát a Startle Response rendszer (SR-LAB, San Diego Instruments) segítségével vizsgáltuk. Az egereket a vizsgálat előtt 3 d-en keresztül minden nap 30 percig szoktatták a készülékhez. Röviden, az egerek startle-válaszát összesen 48 impulzus nélküli próbán45 (40 ms időtartam, 129 dB) és prepulzus + impulzus próbákon (20 ms-os 69, 73 vagy 81 dB-es prepulzus) keresztül mértük. Az előimpulzuspróbák 200 ms-mal az impulzuspróbák előtt voltak. A páros impulzusgátlás százalékos arányát (% PPI) minden egyes prepulzus intenzitáshoz a következőképpen számoltuk ki: % PPI = 100 × ((impulzus egyedül) – (prepulzus + impulzus))/impulzus egyedül.

Egerek vFh és ecset viselkedési vizsgálatai

A vizsgálatot megelőzően az egereket naponta 30 percig szoktattuk a vizsgálati környezethez 3 napig. A kísérleti napokon az egereket egyéni plexiüveg fülkékben helyezték el egy megemelt hálós platformon. Az ecsetvizsgálathoz a bal hátsó mancsot sarkától lábujjhegyig egy 2 mm-es fejű ecsettel 10× véletlenszerű időközönként megsimogattuk. A visszahúzódások százalékos arányát kiszámítottuk. A következő vizsgálati napokon vFhs segítségével megmértük a mechanikus fájdalomcsillapító elvonási küszöbértékeket. Röviden, a bal hátsó mancs plantáris felületét vFh szálakkal stimuláltuk, és a reflexküszöböt a fel-le módszerrel határoztuk meg46. Az állat válaszától függően nagyobb vagy kisebb erősségű vFh-ket alkalmaztunk a hátsó mancsra, hogy egy hat-kilenc pozitív vagy negatív reflexvisszavonásból álló sorozatot hozzunk létre. A válaszok e mintáját ezután úgy alakítottuk át, hogy az adatokat az 50%-os reflexvisszavonási küszöbérték átlagának logaritmusaként fejezzük ki46.

A humán pszichofizikai adatok elemzése

Az adatokat normálisnak vizsgáltuk, és a pszichofizikai teljesítmény különbségeit az egyes teszteknél a kontroll résztvevők és az Usher-szindrómás betegek között párosítatlan Student’s t-tesztekkel vagy Mann-Whitney U-tesztekkel hasonlítottuk össze. A z-transzformációkat használtuk az egyes egyéni adatprofilok összehasonlítására az egészséges kontrollok átlagával és s.d.-jével. A z-pontszámot Excel táblázatok segítségével számoltuk ki a z = (beteg pontszáma – csoport átlaga a csoport átlagának s.d.-je) képlet alapján. A >0 z-értékek funkciógyarapodást jeleznek, ami azt jelenti, hogy a résztvevő érzékenyebb a vizsgált ingerekre az egészséges kontrollokhoz képest. Az egészséges kontroll adathalmaz 95%-os konfidenciaintervallumán kívül eső egyéni z-pontszámok (azaz z-pontszám <1,96 vagy >1,96 s.d.) azonosíthatók. Az egyes tesztekben nyújtott teljesítményeket páronkénti összehasonlításokban Mann-Whitney U-próbával vizsgáltuk, és a P < 0,01 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Az egér rezgési viselkedésének adatelemzése

Az egerek rezgési viselkedését a vízjutalom kifolyójának csúcsán lévő érzékelővel rögzítettük. Az ingerkísérletekben akkor számítottunk találatnak, ha az inger kezdete utáni lehetőségablakon belül (3,5 s) nyalás történt. A viselkedési adatokat a Lab View-ban testreszabott rutinok segítségével gyűjtöttük 1 kHz-es mintavételi frekvenciával, az elemzéshez pedig testreszabott Python szkripteket használtunk. A fogási próbák során téves riasztásra akkor került sor, ha egy ugyanolyan hosszú lehetőségablak alatt nyalás történt. Annak értékelésére, hogy az egerek sikeresen megtanulták-e a detektálási feladatot, a találati arányokat összehasonlítottuk a hamis riasztási arányokkal ugyanazon a tréningülésen belül, kétutas ismételt mérésekkel végzett varianciaanalízis (ANOVA) segítségével, Bonferroni post-hoc teszteléssel.

A detektálási feladatokban nyújtott teljesítmény számszerűsítésére a helyes próbák százalékos aránya helyett a d’ (érzékenységi index) értéket használtuk, hogy figyelembe vegyük a nyalási kritériumok torzítását47. A d’ kiszámításához a következő képletet használtuk: d’ = z(h) – z(fa), ahol z(h) és z(fa) a találati és téves riasztási arányok kumulatív eloszlásfüggvényének normál inverze. A végtelen d’ értékek elkerülése érdekében, amikor minden próbát jelentettek (arány = 1) vagy egyet sem (arány = 0), az arányokat (1½N), illetve (½ N) értékekkel helyettesítettük, ahol N az inger bemutatásának próbáinak száma48. A találati és hamis riasztási arányok z-pontszámait az OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) segítségével számoltuk ki a NORMINV funkcióval. Csak olyan adatokon végeztünk statisztikai teszteket, ahol legalább az egyik genotípus d’ > 1,0-t mutat, ami azt jelzi, hogy ezek az egerek jelentették az ingert. A viselkedési adatokat a Lab View testreszabott rutinjaival gyűjtöttük 1 kHz-es mintavételi sebességgel, az elemzéshez pedig testreszabott Python szkripteket használtunk. A testreszabott kódok és szkriptek kérésre rendelkezésre állnak; további információk a kézirathoz kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.

A nyalási viselkedést nyalási valószínűség, első nyalási frekvencia (Hz) vagy átlagos első nyalási késleltetés (s) formájában számították ki és ábrázolták. Ezeket a mérőszámokat a következőképpen számoltuk ki: a nyalási valószínűség annak a valószínűsége, hogy egy egér legalább egyszer megnyalja a lehetőséget egy inger- vagy fogási kísérletben (legalább 1 nyalást tartalmazó kísérletek/ összes kísérlet). Az első nyalások PSTH-jában az első nyalások latenciáinak binnelt eloszlását mutatjuk az inger- vagy fogási próbákban. Ezen adatok egerek közötti normalizálásához az első nyalások számát elosztottuk a próbák teljes számával. Az első nyalás értékét a bin szélességgel elosztva kiszámítottuk az értéket hertzben (nyalások per s). Az első nyalás átlagos latenciáját (s) úgy számoltuk ki, hogy összeadtuk az egyes találati próbák első nyalási latenciáit, és elosztottuk a próbák teljes számával.

A bőr-ideg preparátum felvételek adatainak elemzése

A kután elülső és hátsó mancs egységeket a vezetési sebességük és a mechanikai ingerekre adott válaszaik alapján kategorizáltuk. Az egységek mechanikai küszöbértékét az első akciós potenciál kiváltásához szükséges hőmérséklet vagy mechanikai amplitúdó alapján számoltuk ki. Minden statisztikai elemzést GraphPad Prism 6.0 és Python segítségével végeztünk. A statisztikai tesztek közé tartoznak a kétirányú, ismételt mérésekkel végzett ANOVA-k Bonferroni post-hoc teszttel, a Student’s t-tesztek, a Mann-Whitney U-tesztek és a Wilcoxon párosított pár tesztek. Az adatok normalitásának értékelésére Kolmogorov-Smirnov-teszteket alkalmaztak. A csillagok az ábrákon a statisztikai szignifikanciát jelzik: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Egerek idegének elektronmikroszkópos adatelemzése

Az egér isiászideg elektronmikroszkópos felvételeinek elemzéséhez a myelinizált és nem myelinizált rostok számát idegenként 12 metszetben számoltuk meg. Az idegenkénti rostok teljes számát ezután extrapolálták az egyes idegek keresztmetszeti területéből.

Beszámoló összefoglaló

A kutatás felépítésével kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.

A cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban.