2010. február 15. (30. évf., 4. szám)
Scott B. Mohler
Egyszerű lépések a sikeres biolumineszcens állatok képalkotásához
A luciferin a biolumineszcens vizsgálatok alapvető szubsztrátja. A biolumineszcencia egy egyszerű reakción alapul, amelyben az ATP a szentjánosbogár (bogár) luciferin luciferáz katalízisét táplálja a fény előállításához, és széleskörű alkalmazásokkal rendelkezik. Alkalmazása biomasszaindikátorként lehetővé teszi a mikroorganizmusok kimutatását a fogyasztói termékekben, a gyártó üzemek felületein, sőt, még annak megállapítására is használták, hogy létezik-e élet a Holdon és a Marson.
A biolumineszcenciát a biológiai folyamatok in vitro és in vivo monitorozására használják, beleértve a génexpressziót és a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat. A luciferint például riporter génvizsgálatokban használják a génszabályozás és -működés tanulmányozására, ahol a luciferinnel jelölt riporter expressziója a rekombináns DNS-technikákban az érdeklődésre számot tartó gén sikeres felvételét jelzi. Detektáló reagensként a luciferin-luciferáz reakciót a piroszekvenálásban használják a bázisok gyors kimutatására a mai nagy áteresztőképességű DNS-szekvenáló rendszerekben.
A közelmúltban a biolumineszcens képalkotás hatékony technikaként jelent meg a különböző sejtpopulációk közvetlen vizsgálatára élő kisállatokban, például egerekben. Ebben a technikában a sejteket (pl. rákos sejtek, őssejtek, T-sejtek) úgy alakítják ki, hogy luciferázt expresszáljanak és világítsanak. A nem invazív vizualizáció élő állatokban egy érzékeny töltéskapcsolós kamera segítségével így lehetővé teszi a betegség progressziójának és regressziójának valós idejű megfigyelését a terápiás kezelés során különböző időpontokban. Az olyan kórképek, mint a neurodegeneratív rendellenességek, a szív- és érrendszeri betegségek, az elhízás és a rák molekuláris alapjainak megértésére alkalmazott technika óriási értéket képvisel a klinikai, diagnosztikai és gyógyszerfejlesztés számára.
A Regis Technologies tudósai azonosították a luciferáz-mérések általános gyengeségeit. A problémák gyakran már a vizsgálat megkezdése előtt jelentkeznek. A szentjánosbogár luciferin érzékeny molekula, és még a jól megtervezett kísérletek is hibás eredményeket adhatnak, ha a luciferint a felhasználás előtt rosszul kezelik és károsítják. Ebben a cikkben leírjuk a luciferin optimális sóját, tisztaságát, kezelését és tárolását, hogy sikeres és konzisztens eredményeket biztosítsunk az állatok képalkotásában és más vizsgálatokban.
Vásárlási megfontolások
A kutatókat gyakran foglalkoztatja, hogy a luciferin melyik formáját használják. A luciferin kálium- és nátriumsóit általában felcserélhetően használják. A molekula oldódása azonban fontos tényező, amelyet néhány vizsgálatnál figyelembe kell venni. A nátriumsó jobban oldódik vízben (>100 mg/ml), mint a káliumsó (55 mg/ml). A szabad savas formát, bár még mindig kapható, nehéz oldhatósága miatt nem gyakran használják.
Mivel néhány szennyeződés különböző módon befolyásolhatja a kísérleteket, a reagens kezdeti tisztasága fontos szempont lehet.
A szintetikus luciferinben ismert szennyeződés az L-luciferin, a D-luciferin enantiomerje (1. ábra). Bár bizonyítottan működik a luciferázreakciókban, az alkalmazott adatgyűjtési paraméterektől függően valószínűleg jelentős eltolódás következik be a fényemissziós csúcsban. Az L-luciferin könnyen kimutatható és számszerűsíthető királis HPLC-vel, és a gyártó által kiadott analitikai tanúsítványban kell feltüntetni. A legtöbb luciferinnek kevesebb mint 0,5% L-luciferint kell tartalmaznia, bár valószínűleg magasabb határértékek is tolerálhatók, amíg az L-luciferin szintje a kísérlet során állandó marad.
A dehidroluciferin (1. ábra) egy szennyeződés, amely a luciferáz inhibitoraként hat, elnyomva a villanás magasságát és a teljes integrációt. Az 1% dehidroluciferinnel adalékolt minta 15 perc alatt a felvillanási magasság kevesebb mint felét és a teljes integráció kevesebb mint 25%-át mutatja. A dehidroluciferin a luciferin szintézise vagy tárolása során képződhet. Ha olyan gyártót választunk, amely alacsony dehidroluciferinszintet szállít, az segít a megbízható és megismételhető eredmények biztosításában.
A luciferin szintéziséből származó számos gyakori nyomnyi szennyeződés gátolhat más enzimeket a komplex rendszerekben, és a tételek vagy gyártók közötti különbségek miatt kísérleti változékonyságot okozhat.
1. ábra. A D-luciferin és a szennyeződések szerkezeti összehasonlítása
Tárolás
A D-luciferin érzékeny a fényre, az oxigénre és a nedvességre, ezért védeni kell. A fény és az oxigén katalizálhatja a luciferin oxidációját dehidroluciferinné. Egy borostyánszínű üvegben, nitrogén alatt, szobahőmérsékleten hagyva a luciferin egy hónap múlva dehidroluciferinné kezd bomlani (2. ábra), de bontatlan üvegben, fagyasztóban legalább két évig stabil. Megfelelő oxigénellátottságú vízben oldva a luciferin néhány nap alatt dehidroluciferinné alakul át.
A luciferint a lehető legkisebb mennyiségben kell megvásárolni és tárolni, hogy a többszöri fagyasztás-felengedés-nyitási ciklusok miatt ne bomoljon dehidroluciferinné. Ha ömlesztve vásárolt, a luciferinreagens felosztása egyszer használatos borostyánszínű üvegcsékbe segít a stabilitás biztosításában. A hosszú távú tárolás fagyasztott oldatként nem ajánlott érzékeny alkalmazásokhoz, például egész állatokon végzett vizsgálatokhoz. A fagyasztott oldatok bomlásának lassítása érdekében fagyasztás előtt töltse fel az oldatot nitrogénnel vagy argonnal.
2. ábra. A luciferin bomlása dehidroluciferinné az idő függvényében 25 ºC-on és -20 ºC-on
Kezelés
A luciferines üveget felbontás után hagyni kell, hogy teljesen szobahőmérsékletűvé váljon, majd nitrogénnel vagy argonnal ki kell tisztítani, mielőtt újra lezárjuk. Ha a luciferinoldatokat néhány órán belül fel kell használni, kevés óvintézkedésre van szükség. Azokat az oldatokat, amelyeket egy nap alatt használnak fel, nitrogénnel vagy argonnal kell öblíteni. Az oldatokat nem szabad több napon keresztül használni, mivel dehidroluciferin képződés lép fel.
Scott B. Mohler ([email protected]) a Regis Technologies termékmenedzsere. Honlapja: www.registech.com.