We chose the 5′-UTR of the well-studied S. cerevisiae CYC1 promoter . A pCYC1min-t (a -143-as pozíciótól kezdve) élesztővel erősített zöld fluoreszcens fehérjével (yEGFP) és a CYC1 terminátorral fuzionáltuk. A teljes CYC1 promóterhez képest a pCYC1min a három TATA-dobozból kettőt tartalmaz, és nem tartalmaz upstream aktiváló szekvenciákat. A pCYC1min egy mérsékelten gyenge promóter, és ezért ideális jelöltnek tűnik a vezérszekvencia pontmutációinak a downstream riporterfehérje expressziójára gyakorolt pozitív és negatív hatásainak kimutatására. A CYC1 promóter 5′-UTR 71 nukleotid hosszú.
A következő elemzésben a CYC1 5′-UTR -1 és -8 közötti pozícióban lévő részét kiterjesztett Kozak-szekvenciának, a -9 és -15 közötti részt pedig upstream régiónak nevezzük. A kiterjesztett Kozak-szekvenciában az adenin öt pozícióban erősen konzervált, míg az upstream régióban egyetlen nukleotid sem erősen konzervált. Az adenin azonban szinte minden helyen a leggyakoribb (lásd Háttér).
A kiterjesztett Kozak-szekvencia
Az eredeti CYC1-szekvencia a -15 és -1 közötti pozícióktól CACACTAAATTAATA (a továbbiakban k 0). Dvir és munkatársai szerint az adenin jelenléte a -1, -3 és -4 pozícióban, valamint a guanin hiánya a -2 pozícióban ezt a vezérszekvenciát szinte optimálissá kell, hogy tegye a magas expresszióhoz. A -2-es pozícióban lévő timin és a -13-as pozícióban lévő citozin gyakorisága azonban kevesebb, mint 20 %, illetve 10 % a magasan expresszálódó S. cerevisiae gének között. Az első szintetikus CYC1 vezérszekvenciánkat (k 1) úgy építettük fel, hogy a -1-től -15-ig minden pozícióba egy-egy adenint helyeztünk.
A k 1-hez kapcsolódó fluoreszcencia szint 6,5 %-kal magasabb volt, mint a k 0-val mért érték. A két vezérszekvencián gyűjtött adatokból azonban nem származott statisztikailag szignifikáns különbség (p-érték =0,13). A k 1-et (az optimalizált vezérszekvenciát) megtartottuk sablonként a következő szintetikus konstrukcióinkhoz, és további 57 szintetikus 5′-UTR-t építettünk a k 1-ben található egyetlen vagy több nukleotid mutációjával.
A szintetikus vezérszekvenciák első csoportját a -1-es pozíciótól a -8-as pozícióig egyetlen pontmutációval készítettük (lásd 1. táblázat). Így csak a kiterjesztett Kozak-szekvenciát módosítottuk, míg az upstream régiót a magas génexpresszióra optimalizált konfigurációban tartottuk a -9 és -15 közötti pozíciókban lévő adeninekkel.
A legmagasabb fluoreszcenciát a k 16-nál (ahol egy guanin helyettesítette az adenint a -5 pozícióban), a legalacsonyabbat pedig a k 9-nél (ahol egy timin helyettesítette az adenint a -3 pozícióban) regisztráltuk. Ezenkívül a k 16 fluoreszcencia szintje statisztikailag szignifikánsan különbözött a k 0 és a k 1 fluoreszcenciájától. A -5 pozícióban lévő guanin okozta fluoreszcencia-erősödés meglepő eredmény volt, mivel a guanin a legkevésbé gyakori nukleotid az élesztő S. cerevisiae vezérszekvenciáiban. Ráadásul a Dvir és munkatársai által végzett munkában ezen a helyen soha nem mutattak ki guanint a magasan expresszálódó gének között, és nem is okozott fluoreszcencia-erősítést .
A k 1-től való statisztikailag szignifikáns különbség hiánya ellenére a k 16-on kívül csak a k 3, a k 10 és a k 24 konstrukciók eredményeztek >5%-os növekedést a k 1 fluoreszcencia-szintjén. Különösen a k 3-ban a -1-es pozícióban egy timin váltotta fel az adenint, a k 10-ben pedig a -3-as pozícióban lévő adenin guaninná mutálódott. Amint arról fentebb beszámoltunk, a -1 és -3 pozícióban lévő adenin magas génexpressziót kell, hogy garantáljon. Mindazonáltal egy ilyen adenin-háttéren úgy tűnik, hogy a -1 vagy -3 pozíciónál ritkább nukleotidokra van szükség a génexpresszió további fokozásához. Ezzel szemben az adenin helyett timin a -3 pozícióban (k 9) volt az egyetlen olyan mutáció, amely a k 1 fluoreszcencia szintjének >5 %-os csökkenését idézte elő. Ez az eredmény összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a -3 pozícióban lévő timin a gyengén expresszálódó génekben bőségesen előfordul (1. a ábra).
A kiterjesztett Kozak-szekvencia pontmutációinak hatása a fluoreszcencia-expresszióra. A fluoreszcenciaszinteket k 1 (a) és k 0 (b) viszonylatában ábrázoljuk. A kontroll a yEGFP gén nélküli élesztőtörzsnek felel meg. A k 1-ben az adenint helyettesítő nukleotid és a mutáció helye az egyes szintetikus vezérszekvenciák neve alatt található. Csillagok, p-érték <0,05 vs. k 1 (a) vagy k 0 (b)
A k 0-hoz képest mind a 25 új szintetikus vezérszekvencia hat és nyolc közötti mutációt tartalmazott. A k 9 kivételével az összes szintetikus 5′-UTR a k 0-nál magasabb fluoreszcenciaszintet mutatott, közülük öt szignifikánsan magasabbat. Ezek közé tartozott a -1, -4 és -5 pozíció. Amint azt már a k 1-gyel való összehasonlításnál is megjegyeztük, úgy tűnt, hogy a START-kodon előtt közvetlenül elhelyezkedő adenin nem jelent különösebb előnyt a génexpresszió szempontjából. Itt egy citozin és egy timin (k 2, illetve k 3) sokkal jobban teljesített, mint egy adenin. A k 0-hoz képest azonban hét pontszerű mutációval több volt a folyásirányban. A -4-es pozícióban egy timin (k 12) eredményezte a legnagyobb fluoreszcencia-növekedést, míg a -5-ös pozícióban mind egy citozin (k 14), mind egy guanin (k 16) >10 %-kal a k 0 fölé emelte a fluoreszcenciát. Mivel a k 0-ban a -2, -5 és -6 pozícióban timin található, a k 0-hoz képest statisztikailag szignifikáns eltérést mutató öt szintetikus 5′-UTR mindegyike két vagy több szomszédos helyen pontmutációval érintett. Három további szintetikus vezérszekvencia (k 10,k 17 és k 24) a k 0-hoz képest >10%-os fluoreszcencia-növekedést okozott, bár ezek a különbségek nem voltak szignifikánsak (p-érték >0,05). k 10 és k 17 szintén kettős pontmutációt tartalmazott a szomszédos helyeken (1. ábra b).
többszörös mutáció guaninra
Az első 25 szintetikus 5′-UTR-szekvenciánk elemzése azt a meglepő eredményt hozta, hogy egyetlen pontmutáció guaninra – amely lényegében hiányzik a magasan expresszált S. cerevisiae gének kiterjesztett Kozak-szekvenciájából – képes növelni a k 1, a génexpresszióra optimalizált vezérszekvencia fluoreszcencia-szintjét. Sőt, öt szintetikus 5′-UTR-ünk egyértelműen (>9 %) növelte a pCYC1min-hez kapcsolódó fluoreszcencia-szintet.
Adataink szerint egyetlen guaninra történő mutáció is fokozhatja a génexpressziót. Két korábbi cikk azonban arról számolt be, hogy egy START kodon elé helyezett több guanin jelentősen csökkenti a fehérjeszintézist. Ezért megvizsgáltuk, hogy a guaninra irányuló többszörös pontmutációk hogyan befolyásolják a pCYC1min transzlációs hatékonyságát, hogy megállapítsuk, felhasználhatók-e a génexpresszió modulálására.
Az adatok szerint a magasan expresszált S. cerevisiae gének között a guanin a legritkább nukleotid a -1 és -15 pozíció között, kivéve a -7 pozíciót, ahol a legritkább nukleotid a citozin. Konstruáltunk egy szintetikus 5′-UTR-t, amely ezt a szekvenciát tükrözi (k 26; 2. táblázat). Ez kikapcsolta a gén expresszióját, amit az is mutat, hogy a megfelelő fluoreszcencia szint nem különbözött szignifikánsan (p-érték =0,21) a negatív kontrollunktól (egy S. cerevisiae törzs, amely nem tartalmazta a yEGFP gént).
Vizsgáltuk, hogy a guaninra (citozin a -7-es pozícióban) irányuló többszörös mutációk eltérő módon befolyásolják-e a génexpressziót, ha a teljes kiterjesztett Kozak-szekvenciát (k 27) vagy az upstream régiót (k 28) fedik le. Mivel a mutációkat a k 1 tekintetében végeztük, az összes nem mutált hely adenint tartalmazott. Meglepő módon azt találtuk, hogy a két konfiguráció egyenértékű volt a génexpresszió szempontjából (p-érték >0,40), és körülbelül felére csökkentette a k 1 fluoreszcencia szintjét.
A k 27-től kezdve a guanint a -1 (k 29), -2 (k 30) és -3 (k 31) pozíciókban adeninnel helyettesítettük, hogy meghatározzuk, vajon egyetlen adenin a START kodon előtti három pozícióban fokozza-e a fluoreszcencia expresszióját, amikor a kiterjesztett Kozak-szekvencia többi helyét vagy guanin, vagy citozin foglalja el. A -1. pozícióban egy adenin nem javította a k 27 fluoreszcenciáját. Érdekes módon a -2 és -3 pozícióban az adenin a k 1 fluoreszcencia szintjének körülbelül 7 %-ára csökkentette a génexpressziót. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az adenin önmagában nem képes javítani a génexpressziót, még akkor sem, ha a -3 vagy -1 pozíciót foglalja el. Általánosabban azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a vezérszekvencia egyetlen pontmutációjának a génexpresszióra gyakorolt hatása erősen kontextusfüggő.
Végezetül, hogy jobban megértsük, mennyire fontos az upstream régió a génexpresszió szempontjából, a guaninok számát fokozatosan csökkentettük hétről (k 28) egyre (k 38). A -9-es pozíciótól kezdve minden egyes lépésben egy guanint adeninnel helyettesítettünk, és azt láttuk, hogy a fluoreszcencia szintje szinte lineárisan nőtt az adeninek számával (2. ábra és Additional file 1). Az utolsó szekvencia, amelyben a fluoreszcencia szintje statisztikailag szignifikánsan különbözött a k 1-hez képest, a k 36 volt, amelyben a guaninok a -13 és -15 közötti pozíciókban voltak jelen. Egy guanin önmagában a -15 pozícióban vagy egy másik guaninnal együtt a -14 pozícióban nem eredményezett szignifikáns különbséget a fluoreszcencia szintjében a k 1-hez képest. Ezért még a magas génexpresszióra optimalizált, kiterjesztett Kozak-szekvencia jelenlétében is, az upstream régió többszörös mutációi nyilvánvalóan kihatnak a fehérjeszintézisre, és felhasználhatók a fehérjék mennyiségének hangolására. Ennek az eredménynek a magyarázatát az alábbi, Számítógépes elemzés című részben mutatjuk be. Érdekes módon négy adeninnel kevert guanin (k 33) az upstream régióban kisebb mértékben csökkentette a k 1 fluoreszcenciát, mint négy guanin egymás után (k 32), ami további megerősítést nyújt arra, hogy az 5′-UTR-en belüli pontmutációk génexpresszióra gyakorolt hatása nagymértékben függ a nukleotidikus kontextustól (Ábra. 2; a k 0 fluoreszcenciával való összehasonlítást lásd az 1. kiegészítő fájlban).
Multiple point mutations to guanine. A k 26-tól k 38-ig terjedő szintetikus 5′-UTR-ek fluoreszcencia-szintjének és a k 1 fluoreszcencia-szintjének arányát közöljük. A vezető szekvencia neve alatt (k 27-től k 38-ig) az upstream régióban található adeninek vagy guaninok számát adjuk meg. A -1, -2 és -3 indexek azt jelzik, hogy a kiterjesztett Kozak-szekvenciában csak a megfelelő pozícióban van adenin. Az i index az összekevertet jelöli (lásd a főszöveget). Csillagok, p-érték <0,05 vs. k 1
A upstream régió
A korábbi elemzés megerősítette, hogy az 5′-UTR-en belüli egyszeri és többszörös mutációknak a génexpresszióra gyakorolt hatása erősen kontextusfüggő. Sőt, adataink egyértelműen kimutatták, hogy nemcsak a Kozak-szekvenciában, hanem az upstream régióban belüli változások is jelentősen befolyásolják a génexpressziót. Ezért pontmutációkat hajtottunk végre a k 1 -9 és -15 pozíciók között (3. táblázat), hogy felmérjük, vajon az upstream régióba helyezve az adenintől eltérő egyetlen nukleotid is megváltoztathatja-e a transzlációs sebességet.
Minden pontmutáció (a k 38-ban lévő kivételével) a k 1-hez tartozónál magasabb fluoreszcencia szintet eredményezett. Figyelemre méltó, hogy nyolc esetben a fluoreszcencia növekedése statisztikailag szignifikáns volt (>10 %-kal magasabb, mint a k 1 fluoreszcencia). Ez a nyolc mutáció négy összefüggő pozíciót foglalt magában, -11-től -14-ig. Ezek közül egyiket sem vették figyelembe Dvir és munkatársai referenciamunkájában .
A -11-es pozícióban egy guanin az adenin helyett (k 47) >15 %-kal növelte a fluoreszcencia expresszióját, míg a citozin és a timin nem volt jelentős hatással. A -12-es pozícióban minden mutáció növelte a k 1 fluoreszcenciáját. A legnagyobb változást (>15 %) egy guanin (k 50) okozta. A -13-as pozícióban lévő mutációk szintén erősen növelték a k 1 fluoreszcencia szintjét. Két pontmutáció – citozin (k 51) és guanin (k 53) – statisztikailag szignifikáns különbséget eredményezett a k 1 fluoreszcenciájában, míg egy timin (k 52) kb. 14 %-kal növelte a k 1 fluoreszcenciáját, de ez nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Meg kell jegyezni, hogy az 58 szintetikus 5′-UTR-ünk közül a k 51-nek volt a legmagasabb a fluoreszcenciaszintje – majdnem 17 %-kal magasabb, mint a k 1é.
Végül a -14-es pozícióban két különböző pontmutáció vezetett a fluoreszcencia növekedéséhez: egy citozin (k 54) és egy timin (k 55) (ábra. 3; a k 0-val való összehasonlítást lásd az 1. kiegészítő fájlban).
A upstream régióban lévő pontmutációk hatása a fluoreszcenciára a k 1-hez képest. A k 1-ben egy adenint helyettesítő nukleotid és a pozíció, ahol a mutáció történt, az egyes szintetikus vezérszekvenciák neve alatt található. Csillagok, p-érték <0,05 vs. k 1
Az upstream régió ezen utóbbi elemzésének eredményei egy másik meglepő eredményt is kiemelnek: a Kozak-szekvenciától felfelé, különösen a -12 és -13 pozíciókban található egyetlen pontmutációk voltak azok, amelyek leginkább fokozták a génexpressziót az adeninekben gazdag kontextusból.
Computációs elemzés
Simulációkat végeztünk az RNAfold programmal, hogy megvizsgáljuk a számított mRNS-szekunder szerkezetek – a hozzájuk tartozó minimális szabad energiákkal (MFE) együtt – és a mért fluoreszcencia-szintek közötti lehetséges összefüggéseket. Elemzésünk magyarázatot ad a -15…-1 régióban az adeninről guaninra (és citozinra) történő többszörös mutáció miatt bekövetkező fluoreszcencia-csökkenésre. Ezzel szemben az RNAfolddal végzett szimulációkból nem derült ki plauzibilis indoklás az egyszeri pontmutációk transzlációs hatékonyságra gyakorolt hatásaira.
Az RNAfold bemeneteként a pCYC1min transzkripciós starthelyétől a CYC1 terminátor poly-A helyéig terjedő mRNS-szekvenciákat használtunk. Mindegyik szekvencia 937 nukleotid hosszú volt. Az előzetes szimulációk alapján megfigyeltük, hogy a 150-200 nukleotid közötti változó hosszúságú poli-A láncnak nincs jelentős hatása az mRNS hajtogatására. Minden mRNS-szekunder szerkezetet 30 °C-on számoltunk (azon a hőmérsékleten, amelyen az S. cerevisiae sejteket növesztettük a FACS-kísérletekhez).
k 0 és k 1 azonos MFE-vel rendelkezik: -241,21 kcal/mol. Ez a legmagasabb – és a leggyakoribb – érték az ebben a munkában elemzett 59 szekvencia gyűjteményében (lásd az 1. kiegészítő fájlt). Az ennek az MFE-nek megfelelő mRNS-szekunder szerkezetet egy óriási hajtű jelenléte jellemzi a -40 és +10 pozíciók között. A hajtűhurok a -31-es pozíciótól a +1-es pozícióig tart, és tartalmazza az általunk itt megcélzott teljes 5′-UTR-részt. A hajtűszár kilenc bázispárból áll, amelyek közül csak egy adott “mismatch”-et a -38 és +8 pozícióban lévő adenin miatt (lásd a 4. a) ábrát).
mRNS-szekunder szerkezetek. a A k 0 és k 1 MFE-nek megfelelő mRNS-szekunder szerkezetben egyaránt jelen van egy óriás hajtű. A hajtűhurok tartalmazza a -15…-1 régiót. Az 5′-UTR-nek az elemzésünkben szereplő része mentes minden párosító kölcsönhatástól a vad típusú konfigurációban (k 0) és a magas fehérjeexpresszióra elméletileg optimalizált konfigurációban (k 1). Az óriás hajtű hurokja a -1-es pozícióban lévő guanin és a -31-es pozícióban lévő citozin közötti bázispárosító kölcsönhatás miatt k 4-ben csökken. Minden bemutatott mRNS-szerkezetben a zöld nyíl a +1 pozíciót, a piros nyíl pedig a -15 pozíciót jelöli. b Az óriás hajtű megszakadása az mRNS-szekunder szerkezet MFE-jének csökkenését idézi elő. k 26 és k 31 az elemzésünkben számított legalacsonyabb MFE-khez társul. A két szekvencia több guanint tartalmaz a kiterjesztett Kozak-szekvenciában, amelyek részt vesznek a CDS-szel való párosító kölcsönhatásokban. Hasonló mintázatot mutat a k 30 is. Itt azonban egy második minihurok a START kodon körül az MFE növekedését idézi elő. A k 26 MFE-je lényegesen alacsonyabb, mint a k 30 és a k 31-é, mivel az upstream régió és a CYC1 terminátor közötti párosító kölcsönhatások miatt egy másik szár is jelen van. Ennek ellenére a k 30 és k 31 fluoreszcenciaszintje csak körülbelül 1,2-szer nagyobb, mint a k 26-é
A guaninok többszörös mutációja akár az upstream régióban, akár a kiterjesztett Kozak-szekvenciában bázispárosító kölcsönhatásokat vált ki a -15…-1 régió legalább egy része és a CDS (yEGFP) vagy a CYC1 terminátor között. Ennek következtében az óriás hajtű megsemmisül, és helyébe egy vagy két szár lép, amelyek csökkentik az mRNS másodlagos szerkezetének MFE-jét (2. táblázat). A legtöbb -241,21 kcal/mol-nál kisebb MFE-értékhez a k 1 -nél alacsonyabb fluoreszcenciaszint társult (5. ábra). Ez az eredmény összhangban van azzal az elképzeléssel, amelyet az is alátámaszt, hogy az 5′-UTR-ben lévő stabil mRNS-szekunder struktúrák csökkentik a fehérje expresszióját. Az általunk mért fluoreszcencia-szintek azonban nem növekedtek arányosan az MFE növekedésével. Ráadásul két esetben (k 32 és k 36) az RNAfold óriás hajtűszerkezetet jósolt az mRNS szerkezetében, miközben a kísérleteinkből származó fluoreszcencia-szintek jelentősen alacsonyabbak voltak, mint a k 1 esetében (5. ábra és Additional file 1).
Az alacsony MFE értékek csökkent fluoreszcencia-expresszióval járnak. Piros sávok, a megfelelő 5′-UTR és k 1 MFE értékei közötti különbség (ΔMFE). Kék sávok, a jelzett 5′-UTR és a k 1 fluoreszcenciaszintje közötti 10-szeres nagyítású arány. A k 1 kivételével a szekvenciák növekvő ΔMFE szerint vannak rendezve. A k 4 kivételével minden szekvencia többszörös pontmutációt tartalmaz a k 1-hez képest. A kék sávok feletti csillagok, p-érték <0,05 vs. k 1
A k 26-ot a -15 és -1 pozíciók közötti legkevésbé gyakori nukleotidok kiválasztásával terveztük a magasan expresszált S. cerevisiae gének közül. A megfelelő MFE (-261,39 kcal/mol) volt a legalacsonyabb az ebben a munkában figyelembe vett transzkripciós egységek együttesén belül. Az MFE mRNS másodlagos szerkezetében nem volt jelen óriás hajtű, mivel a -15…-1 régió két különböző szárba szekvenálódott. A -1 és -6 pozíciók közötti guaninok egy hosszú szár részét képezték, és egy hexamerrel párosultak a yEGFP szekvencia elején (+33 és +38 pozíciók). Ezzel szemben a -9 és -15 közötti pozíciók a CYC1 terminátor egy régiójával párosultak, a +750 és +758 közötti pozíciókban (4. b ábra).
A k 30 és a k 31 esetében a k 26-nál éppen magasabb fluoreszcencia szintet regisztráltunk. Mindkettő különbözött a k 26-tól az upstream régió (amely hét adeninből áll) és egy adenin jelenléte miatt a kiterjesztett Kozak-régióban (a -2, illetve -3 pozícióban). A k 26-hoz hasonlóan a k 30 kiterjesztett Kozak-régiójának első öt nukleotidja és a k 31 első hat nukleotidja a CDS-szel egy szárba volt szekvenálva. A k 26-tól eltérően azonban a k 30 és a k 31 upstream régiói teljesen mentesek voltak minden párosító kölcsönhatástól (lásd a 4. b ábrát). MFE-jük (-244,28, illetve -247,26 kcal/mol) szintén jelentősen magasabb volt, mint a k 26-é. Ez a három szekvencia arra utal, hogy a fehérje expressziójának jelentős csökkentésének feltétele a -1-5 pozíciókban lévő nukleotidok mRNS-szekunder szerkezetbe zárása. Ráadásul nem minden ilyen nukleotidnak kell részt vennie a bázispárosító kölcsönhatásokban. Valójában a -1 (k 30) vagy -2 (k 26 és k 31) pozícióban lévő guanin “szabad”, és felelős egy minihurok jelenlétéért az mRNS szerkezetében.
Ezt a hipotézist azonban a k 29 ellentmondja. Ennek a szekvenciának az MFE-je (-245,97 kcal/mol) hasonló a k 30 és a k 31 szekvenciákéhoz, és a megfelelő mRNS-szekunder szerkezet nagyon hasonló a k 31 szekvenciáéhoz (6. a ábra). Mindazonáltal a k 29-hez kapcsolódó fluoreszcencia szintje több mint 6-szor nagyobb volt, mint a k 31-é, és 45%-át tette ki a k 1-nek.
mRNS másodlagos szerkezetek. a A k 27 csak abban különbözik a k 29-től, hogy a -1 pozícióban adenin helyett guanin található. Az mRNS szekunder szerkezetük azonban nem hasonlít egymáshoz. A k 27-ben a kiterjesztett Kozak-szekvencia bázispáros kölcsönhatásokban vesz részt a CYC1 terminátorral, míg a k 29-ben a kiterjesztett Kozak-szekvencia a CDS-szel egy szárba záródik. A k 27-hez kapcsolódó MFE alacsonyabb, mint a k 29-é, de a két szekvencia fluoreszcenciaszintje között nincs különbség (p-érték =0,20). b A több guanin az upstream régióban olyan mRNS-szerkezeteket eredményez, amelyeket az 5′-UTR és a CYC1 terminátor közötti bázispáros kölcsönhatások jellemeznek. k 28 és k 34 esetében hat guanin van egy szárban a CYC1 terminátorral, míg k 35 esetében csak 5 guanin van egy analóg szerkezetben. Ez az MFE növekedését és következésképpen magasabb fluoreszcenciát okoz
A k 27 osztozott a k 29- k 31-gyel egy csak adeninekből álló upstream régióban. E három szekvenciával ellentétben azonban a k 27 kiterjesztett Kozak-szekvenciája nem tartalmazott adenint. A k 27 MFE-je (-247,04 kcal/mol) hasonló volt, mint a k 29- k 31-é, de a megfelelő mRNS másodlagos szerkezete más konfigurációjú volt. A kiterjesztett Kozak-szekvencia minden nukleotidja (a -7-es pozícióban lévő citozin kivételével) ugyanis nem a CDS-szel, hanem a CYC1 terminátorral (+755 és +762 közötti pozíciók; 6. a ábra) vett részt bázispáros kölcsönhatásban. A k 27 fluoreszcencia szintje valamivel magasabb volt, mint a k 29-é, azaz közel 7-szer nagyobb, mint a k 31-é.
Az eddig figyelembe vett öt szekvenciának (k 26, k 27, k 29- k 31) közös jellemzője egy guaninban gazdag, kiterjesztett Kozak régió, amely az MFE mRNS másodlagos szerkezetében egy szárba szekvenálódott. Négy esetben a kiterjesztett Kozak-szekvencia (részben) a CDS-szel, egy esetben (k 27) pedig a CYC1 terminátorral párosult. A k 26 MFE-je volt a legalacsonyabb, mivel az upstream régiója is szárba szekvenálódott. A másik négy szekvencia nagyon hasonló MFE-értékeket, de meglehetősen eltérő fluoreszcencia-szinteket mutatott.
A k 1-hez képest többszörös mutációval érintett szekvenciák másik csoportjában a kiterjesztett Kozak-szekvenciában csak adeninek voltak, és változó számú guanin volt az upstream régióban.
A k 28, k 34 és k 35 esetében a -15 pozíciótól lefelé 7, 6, illetve 5 guanin volt egy sorban. Bár a k 35 MFE-je egyértelműen magasabb volt, mint a k 28-é és a k 34-é (2. táblázat), a három szekvencia hasonló mRNS-szerkezetet eredményezett, ahol az upstream régió legalább öt guaninja (plusz az első adenin downstream) a CYC1 terminátorral való bázispárosító kölcsönhatás miatt egy szárba záródott (lásd a 6. b ábrát).
Érdekes módon a k 28 MFE-je és fluoreszcencia-szintje is hasonló volt a k 27 és a k 29-éhez. Ennélfogva, még ha a Kozak-szekvencia mentes is volt a párosító kölcsönhatásoktól, az upstream régió szárba szekvenálása elegendő volt ahhoz, hogy a fehérje expressziójának egyértelmű csökkenését biztosítsa. Ez újabb megerősítése annak a szerepnek, amelyet a Kozak-szekvencia feletti nukleotidok játszanak a fehérjeexpresszió hangolásában.
A k 33 esetében (négy guanin, adeninekkel keverve) egy másik MFE mRNS-szekunder szerkezetet kaptunk, amelyben a meghosszabbított Kozak-szekvencia fele és szinte a teljes upstream régió részt vett a CDS-szel való bázispárosító kölcsönhatásokban, ami egy hosszú szárat eredményezett. A k 35-höz képest azonban, ahol az upstream régiónak csak öt nukleotidja volt a CYC1 terminátorral szárba zárva, a k 33 magasabb MFE-t, valamint magasabb fluoreszcenciaszintet mutatott (5. ábra és Additional file 1).
Végül a k 32, k 36 és k 37 esetében (ahol az upstream régióban négy, három, illetve két guanin volt) az RNAfold ugyanazt az MFE-t adta vissza, mint a k 1 esetében. A megfelelő mRNS-szekunder szerkezeteket mind az óriás hajtű jelenléte jellemezte (lásd az 1. kiegészítő fájlt). Kísérleti adatainkkal összehasonlítva ez az eredmény csak a k 37 esetében volt plauzibilis, de nyilvánvaló ellentmondásban volt a k 32 és k 36 méréseivel, amelyek fluoreszcenciaszintje jelentősen alacsonyabb volt, mint a k 1-é (5. ábra). Különösen a k 32 fluoreszcenciája csak a k 1 fluoreszcenciájának mintegy 69%-ának felelt meg. Ezért azt lehet állítani, hogy in vivo a k 32 és a k 1 azonos MFE-vel és mRNS-szekunder szerkezettel rendelkezik, ahogy azt az in silico szimulációk is sugallják.
A többpontos mutációkkal ellentétben a k 1 egyetlen pontmutációi közül csak a k 4 okozott módosítást az óriás hajtű szerkezetében és ennek következtében az MFE csökkenését. A k 4 egy guanint hordoz a -1 pozícióban, amely a -31 pozícióban lévő citozinnal párosul, így a hurok hossza 32 nukleotidról 29 nukleotidra csökken, és az MFE -241,42 kcal/molra csökken (4. ábra a). Adataink szerint ez a minimális változás nincs hatással a fluoreszcencia kifejeződésére. Az összes többi pontmutáció, amely a k 1-nél lényegesen magasabb fluoreszcenciaszintet indukált (nevezetesen a k 16, k 47- k 51 és k 53- k 55), az RNAfold szimulációk szerint ugyanolyan MFE-vel és megfelelő mRNS-szekunder szerkezettel jellemezhető, mint a k 1.
.