Szinonimák

Nem észterezett zsírsavak (NEFA), szabad zsírsavak, telítetlen zsírsavak

Fiziológia

A nem észterezett (“szabad” vagy telítetlen) zsírsavak (NEFA-k) a trigliceridek (a szervezet zsírraktárai) fő összetevői, amelyek három zsírsavból állnak, amelyek egy glicerin gerinchez kapcsolódnak. Egészséges állatokban (amikor esznek vagy nem energiahiányos állapotban vannak) a NEFA-k főként a táplálékkal felvett trigliceridek lebontásából származnak a chilomikronokon keresztül (a lipoprotein lipáz felszabadítja a NEFA-kat a chilomikronmaradványokból). Éhgyomri körülmények között vagy negatív energiaegyensúlyú állapotokban azonban a NEFA fő forrása a szervezet zsírraktárainak hidrolízise.

A zsírszövetben tárolt trigliceridek (zsír) hormonérzékeny lipáz általi hidrolízise NEFA-t és glicerint szabadít fel. A hormonérzékeny lipázt (amely a zsírsejtek citoszoljában található) különböző hormonok, köztük a glükagon (amely a hasnyálmirigy-szigetsejtek α-sejtjeiből szabadul fel alacsony glükózszintre válaszul) és a kortikoszteroidok stimulálják. A zsírból vagy a chylomironokból felszabadulva a NEFA-kat számos szövet, köztük a vázizomzat és a hepatociták energiaforrásként használhatják fel. A hepatocitákban sorsuk az energiaszükséglettől, a hormonegyensúlytól és a szubsztrát elérhetőségétől függően változik, azaz felhasználhatók energiatermelésre (a Kreb-cikluson keresztül), újra trigliceridekké csomagolhatók és nagyon alacsony sűrűségű lipoproteinek (VLDL) formájában exportálhatók, vagy trigliceridek formájában a májban tárolhatók (amelyek feleslegben hepatikus lipidózist okozhatnak), vagy ketonokká alakíthatók.

Módszertan

A szérumban lévő NEFA-k koncentrációjának mérésére szolgáló elsődleges módszer a Cornell Egyetemen alkalmazott kolorimetrikus enzimatikus módszer.

Reakció típusa

Blanked end-point reakció. A blanking csökkenti a hemolízis hatását a NEFA-koncentrációra.

A Cornell Egyetemen alkalmazott eljárás

A háromlépcsős reakció első lépésében az acil-CoA-szintetáz (ACS) katalizálja a NEFA-k (koenzim A) CoA-vá történő acilálását, ami acyl-CoA képződését eredményezi. Ezután az acil-CoA oxidációjából hidrogén-peroxid keletkezik az acil-CoA-oxidáz (ACOD) katalitikus hatása révén. Végül a hidrogén-peroxid a peroxidáz (POD) jelenlétében lehetővé teszi a 4-aminoantipirin oxidatív kondenzációját 3-metil-N-etil-N-(β-hidroxietil)-anilinnel (MEHA), hogy egy kék-lila végtermék keletkezzen, amelynek abszorbancia maximuma 550 nm-en van. A NEFA-koncentráció egyenesen arányos a festéktermék mért optikai sűrűségével.

A reakciókat az alábbiakban mutatjuk be:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA szintézis > Acyl-CoA + AMP + pirofoszfát

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidáz > 2. Acyl-CoA + AMP + pirofoszfát

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidáz >,3-transz-Enoil-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirin + MEHA-peroxidáz > kék-lila komplex+ 3H2O

Mérési egységek

A NEFA-k koncentrációját mEq/L-ben (hagyományos egységek) vagy mmol/L-ben (SI egységek) mérik. Az egység átváltása a következő képlet alapján történik:

mEq/L x 1= mmol/L

Mintával kapcsolatos szempontok

Minta típusa

Szérum vagy EDTA-plazma. A szérumot/plazmát a gyűjtés után minél előbb el kell választani a sejtektől, és a szérumot/plazmát külön csőbe kell helyezni. Hasonlóképpen nem ajánlott a corvac (szérumszeparátor) csövek használata, mivel ezekben a csövekben az értékek kissé (de jelentősen) magasabbak a nem antikoaguláns (piros tetejű) csövekhez képest.

Antikoaguláns

EDTA. Az értékek kevésbé stabilak heparinban, amely szintén magasabb alapkoncentrációt eredményez, mint az EDTA vagy a szérum, és a NEFA-értékek a tárolás során növekednek (Stokol és Nydam 2005).

Szabilitás

Szarvasmarha-szérumban vagy EDTA-plazmában 4°C-on 72 órán keresztül stabil. Szarvasmarha szérumban fagyasztva 1 hónapig (-70°C) stabil. Az értékek 24-48 órán belül emelkednek 24°C-on történő tárolás után szérumban vagy EDTA-plazmában. A NEFA-koncentráció a tárolás után heparinban gyorsan emelkedik. (Stokol és Nydam 2005).

Javaslatok az átmeneti tejelő teheneknél történő mintavételhez

• Antikoaguláns: Vörös felső (szérum) vagy lila felső (EDTA). Kerülje a heparin (zöld tetejű) és a corvac (szérumszeparátor) csöveket.
• Kezelés: A lehető leghamarabb válasszuk el a sejtektől, az eredmények hamis változásainak minimalizálása érdekében tartsuk hűvösen (a NEFA-k különösen instabilak), a lehető leghamarabb juttassuk el a laboratóriumba.
• A gyűjtés időpontja: A tehenekből akkor vegyünk mintát, amikor bejönnek az etetőállásokba (lásd alább).
  • Prepartum NEFA-k: A tehenektől az ellés előtt 2-14 nappal kell mintát venni.
  • Postpartum NEFA-k: A tehenektől 3-14 napos tejelválasztás után gyűjtsünk mintát. Mind a szülés utáni NEFA-k, mind a BHB mérése a Cornell Egyetem klinikai patológiai laboratóriumában a laktáló tehenek energiastátuszának értékelésére szolgáló átmeneti tehén energiaprofilban történik.
• Tehenek száma: Az állományszintű vizsgálathoz állományonként legalább 12 állatból kell mintát venni (a vizsgálat leírása a vizsgálat értelmezése részben található). Ez lehet üszők és >2 paritású tehenek keveréke.
• Összevont minták: A tehenektől származó egyedi minták összevonása az állomány energiaállapotának értékelésére NEM ajánlott. A Cornell Egyetemen végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az összevont mintákból származó eredmények kevésbé érzékenyek, mint az egyedi tehenek vizsgálata (legalább 12 állat egy állományban), amikor a prepartum vagy postpartum NEFA-t használják a túlzottan negatív energiaegyensúly kimutatására az átmeneti tejelő teheneknél.

Interferenciák

• Lipémia, icterus: Ismeretlen hatás (szarvasmarhában ritka).
• Hemolízis: A laboratórium által alkalmazott módszertől függően a hemolízis csökkenti vagy növeli a NEFA-értékeket. A Cornell Egyetemen használt, kitakart módszer szerint a súlyos hemolízis (hemolitikus index > 800 egység) enyhén csökkenti a NEFA-koncentrációt a szarvasmarhák vérében. Lipémiás és ikterikus zavaró tényezők nem befolyásolják lényegesen a NEFA-koncentrációt a Cornell Egyetemen alkalmazott módszerekkel.
• Feszültség/terhelés/stressz: Ezek a körülmények, amelyek katekolamin- vagy ACTH-felszabadulást indukálnak, növelik a NEFA-koncentrációt azáltal, hogy a hormonérzékeny lipázon keresztül serkentik a lipolízist. Ezeket a körülményeket minimalizálni kell, amikor vérmintát veszünk NEFA-méréshez.
• A mintavétel időzítése: A NEFA-értékek valószínűleg magasabbak lesznek azoknál a teheneknél, amelyek napi etetésre érkeznek (valószínűleg bizonyos fokú negatív energiaegyensúlyban vannak), szemben azokkal a tehenekkel, amelyeket éppen most etettek (ez utóbbi tehenekben a lipolízis gátolt lesz). A gyűjtés közvetlenül az etetés előtt ajánlott.

A vizsgálat értelmezése

A NEFA-vizsgálatot többnyire tejelő szarvasmarháknál végzik annak megállapítására, hogy az állomány túlzottan negatív energiaegyensúlyban van-e. Ezt a vizsgálatot nem kell elvégezni. Inkább állományszintű, mint egyedi állatszintű vizsgálatként alkalmazzák, és az eredményeket egy határkoncentráció vagy a határérték feletti értékeket mutató állatok százalékos aránya és a felső referenciahatár feletti értékek tekintetében értelmezik. A NEFA-mérés bármely más fajnál is elvégezhető a túlzott negatív energiaegyensúly markereként. Ezt leggyakrabban teveféléknél (amelyeknél ilyen körülmények között májlipidózis alakul ki), más kérődzőknél (pl. kecskéknél, juhoknál) végzik annak megállapítására, hogy fennáll-e a ketózis veszélye, valamint lovaknál (ló metabolikus szindróma esetén). Megjegyzendő, hogy a referenciahatár alatti koncentrációk klinikailag nem relevánsak.

Növekedett koncentrációk

• Fiziológiai: Az edzés katekolaminok és ACTH felszabadulását indukálja, ami serkenti a hormonérzékeny lipáz hidrolitikus aktivitását, hogy elősegítse a zsírmobilizációt a felesleges energiaszükséglet kielégítése érdekében. Ez a folyamat növeli a NEFA-k koncentrációját a vérben.
• Fajtakülönbségek: Számos tanulmány kimutatta, hogy a Jersey teheneknél a szülés után a NEFA-k alacsonyabbak, mint a holstein teheneknél, ezért a holstein tehenekre kidolgozott irányelvek (lásd alább) nem feltétlenül alkalmazhatók a Jersey tehenekre (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Negatív energiaegyensúly a tejelő teheneknél: A tejelő tehenek a periparturient (átmeneti) időszakban a fejlődő magzat és a tejtermelés magas energiaigénye miatt mindig negatív energiaegyensúlyban vannak (különösen a nagy tejtermelőkre való szelekcióra helyezett hangsúly miatt). Ez a negatív energiaegyensúlyi állapot azonban túlzott mértékű lehet, és az érintett tehenek a szülés utáni korai időszakban ki vannak téve a gyomor-bélrendszeri (elmozdult hasnyálmirigy), metabolikus (klinikai ketózis) és fertőző (pl. metritisz) betegségek kockázatának. Ezért a tejtermeléssel foglalkozó szakemberek gyakran ellenőrzik a tejelő állományokat a túlzott negatív energiaegyensúly szempontjából a NEFA-k vizsgálatával, akár önmagában a szülés előtti vagy utáni teheneknél, akár a metabolikus profil részeként a szülés utáni teheneknél. E vizsgálatok eredményei értelmezhetők az egyes tehenek szintjén (azaz egy bizonyos határérték feletti NEFA-érték túlzott negatív energiaegyensúlyt jelez) vagy az állomány szintjén (azaz a vizsgált tehenek egy bizonyos határérték feletti NEFA-értékeket mutatnak). A túlzott negatív energiamérleg azonosítása az egyes teheneknél (és ami még fontosabb) az állományban azt jelzi, hogy változtatásokra van szükség a takarmányozásban (pl. az emeletes takarmányterület növelése, az adag energiasűrűségének növelése) és az átmeneti tehenek kezelésében az energiaigény és az átmeneti tehenekre nehezedő stressz csökkentése érdekében. Az alábbi értelmezési iránymutatások a Cornell Egyetemen végzett vizsgálatokon alapulnak, és a “veszélyeztetett”, TMR-rel etetett holstein tehenektől 2-14 nappal az ellés előtt (prepartum NEFA) vagy 3-14 nappal az ellés után (postpartum NEFA) gyűjtött mintákra érvényesek. A teljes vegyes takarmányozású (TMR) állományok szubklinikai ketózis szempontjából történő értékelésénél legalább 12 “veszélyeztetett” tehénből javasolt mintavételt végezni (Ospina et al 2013).
  • Tehénszintű vizsgálat
    • Prepartum NEFAs: Az ellés utáni betegségek (elmozdult abomasum, metritisz/visszamaradt placenta és klinikai ketózis), csökkent tejhozam és csökkent reprodukciós teljesítmény előfordulása az első 30 napban a tejben olyan (TMR-rel etetett) holstein tejelő teheneknél, amelyek NEFA értéke > 0,30 mEq/L, ha 2-14 nappal az ellés előtt vizsgálják.
    • Postpartum NEFA-k: Az ellés utáni betegségek (elmozdult bendő, metritisz/visszamaradt méhlepény és klinikai ketózis), a tejhozam csökkenése és a szaporodási teljesítmény csökkenése az első 30 napban a tejben a (TMR-rel etetett) Holstein tejelő teheneknél, amelyek NEFA értéke > 0,60-0,70 mEq/L, amikor az ellést követő 3-14 napon belül vizsgálják. A Cornell vizsgálatokban az ellés utáni NEFA-értékek valójában jobb előrejelzői voltak, mint az ellés utáni β-hidroxibutirát koncentráció vagy az ellés előtti NEFA-értékek.
  • Csordaszintű vizsgálat
    • Prepartum NEFA-értékek: Az ellés utáni anyagcsere- és fertőző betegségek, csökkent tejtermelés vagy csökkent reprodukciós teljesítmény jelentősen megnövekedett kockázata, ha a vizsgált ellés előtti tehenek >15%-ának NEFA értéke > 0,30 mEq/L. Megjegyzendő, hogy mint fentebb jeleztük, az egyes tehenekből származó minták összevonása nem ajánlott az állományszintű vizsgálathoz.
    • Postpartum NEFA-k: Az állomány szintjén jelentősen megnő az ellés utáni anyagcsere- és fertőző betegségek, a csökkent tejtermelés vagy a csökkent reprodukciós teljesítmény kockázata, ha a vizsgált ellés utáni tehenek >15-20%-ának NEFA-értéke > 0,70 mEq/L. Megjegyzendő, hogy mint fentebb jeleztük, az egyes tehenekből származó minták összevonása nem ajánlott az állományszintű vizsgálathoz.
• Hepatikus lipidózis tejelő szarvasmarhákban: Egy vizsgálatban a NEFA:koleszterin arány >0,2 (SI egységek) 9,9 esélyhányadossal járt arra, hogy az állat májlipidózisban szenved (a máj >10%-os lipidtartalmaként definiálva), és ez a határérték érzékenyebb volt (63%, 85%-os specificitással), mint a BHB, a NEFA önmagában vagy az AST aktivitás (>120 U/L) a májlipidózis diagnózisára (a vevői működési jelleggörbe alatti terület vagy AUC alapján). A vizsgálatban szereplő állatoknál azonban a laktációt követően különböző időpontokban végeztek vérméréseket (Mostafavi et al 2013).
• Negatív energiaegyensúly kisállatoknál: Ez elsősorban diabetes mellitusban fordul elő. Inzulinhiányos vagy inzulinrezisztens állapotban a hormonérzékeny lipáz gátlása megszűnik. A hormonérzékeny lipáz aktivitásának szabályozási egyensúlyhiánya fokozza a zsír mobilizációját a zsírszövetből a májszövetbe, megemelve a NEFA-k koncentrációját.
• Negatív energiaegyensúly tevefélékben: A beteg, stresszes tevefélék, különösen a vemhes nőstények, ki vannak téve a máj lipidózis kialakulásának kockázatának. A NEFA mérése elvégezhető annak meghatározására, hogy negatív energiaegyensúlyban vannak-e. A > 0,8 mEq/L NEFA-val rendelkező tevefélék (Tornquist et al 2001) fokozottan ki vannak téve a lipidózis kockázatának. Az anorexiás tevefélék NEFA-értéke gyakran megemelkedett, de ez alatt az érték alatt van, és előfordulhat, hogy nem alakul ki lipidózis.