A multiplex ligációfüggő szondaamplifikáció (MLPA) az MRC-Holland által 2002-ben kifejlesztett molekuláris technika. Dióhéjban az MLPA egy érzékeny technika, amely lehetővé teszi a nukleinsav-szekvenciák gyors és hatékony mennyiségi meghatározását. Világszerte számos laboratóriumban végzik, és alkalmazható egy gén kópiaszám-változásainak (például deléciók vagy duplikációk) kimutatására, a DNS metilációs állapotának meghatározására, az egynukleotid-polimorfizmusok (SNP-k) és pontmutációk kimutatására, valamint az mRNS mennyiségi meghatározására. Ezért számos kutatási és diagnosztikai területen használják, többek között a citogenetikában, a rákkutatásban és a humángenetikában.

Hogyan működik?

AzMLPA a következő lépésekből áll (1. ábra):

1. Denaturálás
2. Hibridizáció
3. Ligálás
4. Amplikálás (PCR segítségével)
5. Fragment szétválasztás és adatelemzés

1. ábra – Az MLPA technika vizualizációja (adaptálva Schouten, Jan P., et al.1). Megfigyelhetünk egy tipikus, MLPA-analízissel kapott elektropherogramot is, amelyen a 46-os exon deléciója látható (piros nyíl). (Electropherogram adaptálva https://commons.wikimedia.org/wiki/File:MLPA_in_GeneMarker.jpg)

1 – Denaturálás és 2 – Hibridizáció

A denaturálás a lágyított DNS-szálak szétválasztását jelenti, így a kettős szálú DNS egyszálúvá válik.

A hibridizáció során a DNS-mintát specifikus szondákkal hibridizáljuk. Mivel ez egy multiplex technika, minden mintát akár 60 szondával is elemezhet egyszerre, így különböző helyeket célozhat meg!

A szondák olyan primer szekvenciával rendelkeznek, amely az amplifikáció során a PCR-primerhez kötődik. Minden különböző szonda ugyanazzal a primerhez kötődő szekvenciával rendelkezik. Ezenkívül a szondák rendelkeznek egy, a célhelyhez komplementer hibridizációs szekvenciával is, amely lehetővé teszi a szonda kötődését a DNS-hez. Mindkét szonda a DNS-szál szomszédos helyein fog hibridizálni.

A szondapár egyik szondája tartalmaz egy stuffer-szekvenciát, amely az egyes célhelyeken eltérő hosszúságú. A stuffer-szekvencia hossza a különböző szondák között változik, ami lehetővé teszi a multiplexelést. Így várhatóan minden egyes amplifikációs termék egyedi hosszúságú lesz!

3-Ligálás

A ligálási lépés összeköti a két szondát. Ebben a lépésben egy speciális enzimet, a DNS-ligázt használjuk. Ez megköti a célhelyen lévő DNS-szál szomszédos helyein már hibridizált szondákat. Az MLPA protokollokban használt ligáz a ligáz-65, egy NAD-függő ligáz enzim, amely más alkalmazásokban is hasznos lehet.

Most felmerül a kérdés: ha a célunk a két szonda ligálása, akkor miért különálló molekulákról van szó? Nos, mindkét szonda tartalmazza a PCR-primerek kötőhelyeit. Ez azt jelenti, hogy ha a szondákat egyetlen molekulaként használnánk, akkor a DNS-célhely nélkül is kapnánk amplifikációs terméket, tehát nem specifikus amplifikációt kapnánk. A ligáz enzim rendkívül specifikus: ha a szonda és a célhely között bármilyen eltérés van, a ligáz nem lesz képes megkötni a szondákat, és nem következik be amplifikáció. Következésképpen az MLPA specifikus pontmutációkat mutat ki, és még az álgének és a valódi célgén között is különbséget tesz.

4-Amplifikáció

A következő lépés az amplifikáció, amely lényegében egy polimeráz-lánc reakció (PCR) (1. táblázat). A PCR lépéshez polimerázt, dNTP-ket, valamint egy előre- és egy hátrafelé irányuló primert adunk. Mivel az összes szonda azonos PCR-primer szekvenciával rendelkezik, csak egy pár univerzális primert kell hozzáadni az összes célpontunk vizsgálatához. Az előre irányuló primer fluoreszcens jelöléssel van ellátva, ami lehetővé teszi a vizualizálást és a mennyiségi meghatározást az elemzés során.

Táblázat 1 – Az MLPA reakció termocycler programja

5-Fragment szétválasztás és adatelemzés

Az amplifikáció után a fragmentumokat kapilláris elektroforézissel választjuk szét. A kapilláris elektroforézis a fragmentumokat hosszuk alapján választja szét, és a különböző hosszúságú fragmentumokat csúcsmintázatként, úgynevezett elektropherogramként jeleníti meg (1. ábra). Minden egyes amplikonnak más-más ismert mérete van az egyes specifikus szondák puffer szekvenciája miatt, és ezért az adatelemzés során minden amplikon számszerűsíthető.

A kapilláris elektroforézissel kapott adatok lesznek az elemzés bemenete. Az MRC- Holland egy ingyenes szoftvert biztosít az adatelemzéshez – Coffalyser.

Az egyes mintákat egy referencia-mintakészlettel összehasonlítva megkaphatjuk a szondák arányát. Ez a szondaarány tájékoztat minket arról, hogy egy génnek hány példányszáma van. Mivel a legtöbb emberi gén diploid, ha a minta két kópiát mutat, az arány 1,0 lesz; azaz a minta szondái ugyanannyi gént kaptak, mint a referencia minta.

Ha azonban az arány 0,5, akkor a génnek csak egy példánya volt az egyénben, ami valószínűleg a célgén heterozigóta delécióját jelenti. Ha viszont az arány 1,5, akkor valószínűleg egy gén heterozigóta duplikációjáról van szó.

A MRC-Holland számos különböző készletet kínál, amelyek megoldást nyújthatnak az Ön problémájára. Ha azonban valami kicsit homályosabb dolgot szeretne megtalálni, vagy olyasmit szeretne vizsgálni, ami egyik kitben sincs benne, akkor megtervezheti saját szondáit. Javaslom, hogy figyelmesen olvassa el a szintetikus szondatervezés protokollját.

Az MLPA előnyei

• Az MLPA egy rendkívül érzékeny, robusztus és nagy áteresztőképességű technika.
• Ez képes megkülönböztetni a pontmutációkat, valamint a gének duplikációját/delécióját. Ezért nagy előnye van más technikákkal, például a szekvenálással szemben, amelyek csak a pontmutációkat képesek megtalálni. Ráadásul a FISH-vel ellentétben az MLPA a kis génváltozásokat is képes kimutatni.
• Az eredmények 24 órán belül rendelkezésre állnak, és mivel multiplex reakcióról van szó, gyors és hatékony információgyűjtést tesz lehetővé.
• Az MLPA protokoll kis módosításai számos alkalmazást tesznek lehetővé. Például egy további emésztési lépés hozzáadásával az MLPA a DNS metilációs mintázatának kimutatására is használható (Metilációs specifikus-MLPA (MS-MLPA)).

Az MLPA korlátai

• Az MLPA rendkívül érzékeny a szennyeződésekre. Ezért a minták előkészítése és a technika végrehajtása során rendkívüli óvatosságra van szükség.
• Egy ritka polimorfizmus vagy mutáció miatt csökkenhet a szonda jele, és szükség lehet más technikákkal történő vizsgálatra.

Az MLPA egy nagyszerű technika, amely változatos alkalmazásokhoz használható, és gyorsan és hatékonyan ad eredményeket. Azonban nem jár csuklás nélkül. Mint tudjuk, minden technikának vannak bizonyos hátrányai, és minden egyes alkalmazást alaposan meg kell vizsgálni, hogy biztosan a leghatékonyabb és legérzékenyebb technikát használjuk.

Használta már az MLPA-t? Mi a véleménye erről a technikáról?