A morpholino oligók fejlett eszközök az RNS-en lévő helyek blokkolására a sejtfolyamatok akadályozása érdekében. A morfolinó oligók specifikusan kötődnek a kiválasztott célhelyhez, hogy megakadályozzák a sejtkomponensek hozzáférését az adott célhelyhez. Ez a tulajdonság kihasználható a transzláció blokkolására, a splicing blokkolására, a miRNS-ek vagy célpontjaik blokkolására, valamint a ribozimaktivitás blokkolására.
Transzlációs blokkolás: A transzlációs iniciációs komplex sztérikus blokkolásával a morfolinók számos célszekvencia expresszióját képesek olyan mértékben kiütni, hogy a meglévő fehérje lebomlásának megvárása után a célfehérje sávja eltűnik a Western blotokról. Sok antisense típustól (pl. siRNS, foszforotioátok) eltérően a morfolinók általában nem okozzák RNS-célpontjaik lebomlását; ehelyett a cél-RNS biológiai aktivitását blokkolják, amíg az RNS természetes módon le nem bomlik, ami felszabadítja a morfolinót. Ez azt jelenti, hogy az RT-PCR nem alkalmas a morfolinók által okozott transzlációs blokkolás vizsgálatára.
Splice blokkolás: A pre-mRNS splicingben részt vevő helyek blokkolásával a morfolinók felhasználhatók a normál splicing események módosítására és ellenőrzésére. Ez az aktivitás kényelmesen vizsgálható RT-PCR segítségével, a sikeres splice-módosítás az RT-PCR termék sávjának változásaként jelenik meg az elektroforetikus gélen. A sáv eltolódhat egy új tömegbe, vagy ha a splice-módosítás a transzkript nonsense-mediált bomlását váltja ki, a vad spliced sáv veszít intenzitásából vagy eltűnik.
Mint minden génkiütő reagensnek, a morfolinóknak is aktívan be kell jutniuk a legtöbb sejtbe. A morfolinókat számos módszerrel be lehet juttatni a tenyésztett sejtekbe, beleértve az adherens sejtek kaparással történő feltöltését, az elektroporációt és még a mikroinjekciót is. Az Endo-Porter hordozó reagensünk azonban általában kitűnő hordozást biztosít a tenyésztett sejtekbe, ami az egy sejtre jutó morfolinó mennyiségét, a sejtpopulációban való egyenletes eloszlást, a hordozás reprodukálhatóságát és a legtöbb sejttípus esetében az ajánlott koncentráció mellett a nem-toxicitást illeti. Állatkísérletekhez a Vivo-Morfolinóink a hozzájuk csatolt szállítóegységgel a vérből jutnak be a sejtekbe i.v. beadást követően, vagy a helyi injekciókat körülvevő szövetek sejtjeibe; ezek a legkényelmesebb antiszenz oligók a sejtkultúrákban vagy sejtmintákban történő felhasználáshoz is, mivel nem igényelnek további hatóanyagot a citoszolikus szállításhoz.
A morfolino oligók gyökeresen különböznek a természetes nukleinsavaktól, a ribóz vagy dezoxiribóz cukorrészeket metilén-morfolin gyűrűkkel helyettesítik, a DNS és RNS anionos foszfátjait pedig nemionos foszforodiamidát kötésekkel helyettesítik. Minden egyes morfolingyűrű megfelelően pozícionálja a standard DNS-bázisok (A,C,G,T) egyikét a párosításhoz, így egy 25 bázisú morfolinoligo erősen és specifikusan kötődik a komplementer 25 bázisú célhelyéhez egy RNS-szálban Watson-Crick párosítás révén. Mivel a Morpholino oligók töltés nélküli gerincét az enzimek nem ismerik fel, a nukleázokkal szemben teljesen stabilak.
Bátorítjuk Önt, hogy egy pontosabb és erőteljesebb eszközt hozzon létre kísérleti kihívásaihoz. Hívja fel a Gene Tools doktori szintű ügyfélszolgálati csoportunkat, hogy elkezdhesse a Morpholinók használatát a vizsgálataiban. Tel: (541) 929-7840 1. mellék.
- A szállítás értékelése
- Az oldhatóság és a morfolinók
Mint minden génkiütő szer esetében, a morfolinók hatékony szállítása kulcsfontosságú. Míg az embrionális mikroinjekciót alkalmazó kísérleteknél a szállítás megerősítése nem döntő fontosságú, addig a tenyésztett sejtekkel végzett kísérleteknél fontos a szállítás megerősítése. Endo-Porter hordozó reagensünk általában egyszerű, megbízható hordozást biztosít a legtöbb sejttípus esetében. A sejtek citoszoljába való jó bejutást fluoreszcens jelölésű Morpholino segítségével értékelheti. Javasoljuk, hogy erre a célra az olcsó fluoreszcein-tagolt Standard Control oligónkat használja.
A fluoreszcens Morpholino használatakor a szállítás megerősítéséhez kezdje 10 mikroMol Morpholino oligo koncentrációval a táptalajban. Ez elég nagy koncentráció ahhoz, hogy 16 óra elteltével a fluoreszcensen jelölt Morpholinónak fluoreszcens mikroszkópiával láthatónak kell lennie a citoszolban. A tenyészlemezekben lévő sejtek megfigyeléséhez a legjobb választás egy inverz fluoreszcens mikroszkóp. Élő (nem fixált) sejtek megfigyelése. Használjon száraz objektívet az elérhető legnagyobb numerikus apertúrával, hogy a lehető legtöbb fényt gyűjtse össze a sejtekről. A sikeres szállítás a citoszol egészén diffúz fluoreszcenciában nyilvánul meg. A pontszerű fluoreszcencia általában azt jelzi, hogy az oligo csapdába esett az endoszómákban, ezért hagyja figyelmen kívül a pontszerű foltokat, és keresse a diffúz fluoreszcenciát.
A saját szekvenciájú morfolino Endo-Porterrel történő tényleges kísérletekhez általában csak 1-5 mikromoláris koncentrációra van szüksége a legtöbb mRNS hatékony sterikus blokkolásához.
Noha a morfolinó oligók sokkal jobban oldódnak, mint más nem ionos szerkezeti típusok (például a PNA-k), néhány magas G-tartalmú (>30%) morfolinónak korlátozott az oldhatósága. Emellett a vöröset kibocsátó lissamin fluorunk csatolása néha csökkenti az oligók oldhatóságát. Az oldhatóság az oligoszekvenciától függően változik, és nehéz megjósolni. Az alábbi ajánlások segíthetnek az oligo aktivitásának fenntartásában, ha a szekvencia rossz oldhatóságú.
A hosszú távú tárolás érdekében a Morpholino törzsoldatokat a legjobb liofilizáltan tárolni, A következő legjobb választás az oldatban, szobahőmérsékleten történő tárolás. A Morpholino törzsoldatok készítése 1 millimoláris vagy annál alacsonyabb értéken segít elkerülni az oldhatósági problémákat. A fagyasztási-olvasztási ciklusok vagy a hosszú távú 4C-on történő tárolás a morfolinók kicsapódását vagy tartályban való társulását okozhatja, és csökkentheti az oldat aktivitását; javasoljuk a szobahőmérsékletű tárolást szorosan lezárt tartályokban, és a hibás üvegzárás esetén a párolgás elkerülése érdekében célszerű a készleteket párás környezetben, például humidorban (pl. egy nyitott, vízzel teli főzőpohárral ellátott haranglábasban) tárolni. Ügyeljen arra, hogy az oligók ne száradjanak ki, mivel a kiszáradt oligókat nehéz vagy lehetetlen újra feloldani (bár a fagyasztva szárított oligók viszonylag könnyen feloldódnak). A fiolát sötét dobozban vagy fóliába csomagolva érdemes tartani, mivel a fluorral jelölt oligók fényben fotoblokkolhatnak.
Az oldatban történő aggregáció idővel a biológiai aktivitás csökkenését okozhatja, és ez a szobahőmérsékleten tárolt oldatokban is előfordulhat. Ez bizonyos esetekben visszafordítható 5 perces 65C-on történő melegítéssel vagy a legtöbb esetben autoklávozással (használja a folyadékciklust). Az oligók nagyon hőstabilak, és többszöri autoklávozást is elviselnek lebomlás nélkül. Gyakran előfordul, hogy az autoklávozás feléleszti az oligok aggregációja miatt némi aktivitást vesztett állományt.
A DNS-t, az RNS-t és a legtöbb génkiütési reagenseket a kísérletek során általában jégfürdőben tárolják, hogy minimalizálják a nukleázok általi lebomlást. Mivel a morfolinók teljesen ellenállnak az enzimatikus lebomlásnak, és a vizes oldatok szobahőmérsékleten kémiailag korlátlan ideig (évekig) stabilak, javasoljuk, hogy a kísérletek során a morfolinók törzsoldatait szobahőmérsékleten tartsa. A törzsoldatok jégfürdőben történő hűtése egyszerűen a Morpholino kicsapódását kockáztatja.
Ezek az óvintézkedések a legtöbb szekvencia esetében több mint szükségesek, de rutinszerű alkalmazásuk segít elkerülni a kellemetlen meglepetéseket abban az esetben, ha alacsony oldhatóságú szekvenciával találkozik.