Introduction

A 4-hidroxi-l-prolin (hidroxiprolin) egy nem fehérjeproteogén aminosav, amelynek molekulatömege 131,13 g/mol, és a kollagén bioszintézis során a prolin poszttranszlációs hidroxilációjával szintetizálódik (1. ábra). A fiziológiás és patológiás kollagén-metabolizmus vizsgálata során leggyakrabban a plazma, a vizelet és a testszövet hidroxiprolinjának mérését használják. Ezért a hidroxiprolin meghatározása hasznos információt nyújt a kollagén-anyagcsere zavarai által okozott betegségek diagnózisához és prognózisához (1). Ilyen állapotok például a pajzsmirigy túlműködés, a hiperparathyreosis, az akromegália, a Paget-kór, az osteomalacia, a ricketsia, a Marfan-szindróma, az osteogenesis imperfecta, a sclerodactylia, a dermatomyositis és a Cushing-szindróma (2).

A májban, tüdőben, vesében, bőrben és más szervekben fellépő fibrózis képes krónikus májgyulladás, májszklerózis, májrák, tüdőfibrózis és glomerulonephritis kialakulására (3). Ezért rendkívül fontos a fibrózis kialakulásának megelőzése és súlyosságának csökkentése a betegeknél. A hidroxiprolin a fibrózis súlyosságának fontos diagnosztikai indikátora.

A hidroxiprolin mérése plazmában, vizeletben és testszövetben kolorimetriás módszerekkel, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) és áramlási injekciós analízissel lehetséges (4-6). Ezek a módszerek azonban alacsony érzékenységük miatt nagy mintamennyiséget igényelnek. Ezenkívül a HPLC hosszú elválasztási időt igényel minden egyes minta esetében. Az utóbbi években a folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS) nagy érzékenysége és rövid elválasztási ideje miatt előnyösnek bizonyult.Az LC-MS-t a szennyezett anyagokkal szennyezett vizeletben és vizeletben lévő gyógyszerek alacsony koncentrációjának mérésére használták (7-9). A jelen tanulmány célja az új LC-MS módszer alkalmazása volt a hidroxiprolin mérésére. A fibrózis indikátoraként a hidroxiprolint egy fibrózisos patkánymodell májában és tüdejében LC-MS módszerrel mértük, és összehasonlítottuk a korábbi, HPLC és kolorimetriás módszerekkel kapott eredményekkel.

Anyagok és módszerek

Etikai nyilatkozat

A vizsgálati protokollt a Harbini Orvosi Egyetem (Harbin, Kína) etikai bizottsága hagyta jóvá. A protokoll tartalmazta az írásbeli beleegyező nyilatkozat beszerzésének standard eljárását, amelyet a HarbinMedical University etikai bizottsága hagyott jóvá.

Reagensek

Dimetilnitrózamin (DMN) és hidroxiprolin a Nacalai Tesque Inc. (Kiotó, Japán). A Nembutalt a Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Oszaka, Japán) és ableomicint a Nihon Kayaku Inc. (Tokió, Japán). Minden más vegyszer reagens minőségű volt.

Tüdő- és májfibrózis modelljének előállítása patkányokban

A tüdőfibrózis modelljét öt hetes Wistar patkányoknál hoztuk létre bleomicin (BLM, 0.30U/100 g, i.p.) bejuttatásával a légcsőbe, nembutal (50 mg/kg) altatásban.Egészséges patkányoknak 0,9%-os sóoldatot adtak (kontroll).

Májfibrózis modelljét hoztuk létre hét hetes Wistar patkányokban DMN (40 mg/kg,i.p.) egyszeri beadásával. Normál, egészséges patkányok voltak a kontrollok, akiknek 0,9%-os sóoldatot adtak be (kontroll). A tüdőfibrózis modelljének és a gyűjtőszövetnek az elkészítése a korábbi vizsgálatokban leírt módszereken alapult (10,11).

A hidroxiprolin mérése a tüdőfibrózis patkánymodelljében kolorimetriás módszerrel

A bal tüdőt eltávolítottuk, megmértük (~0.3 g) és 5%-os triklór-ecetsav oldatban (x10 térfogat) cellahomogenizátorral (Eilard, Berlin, Németország) 8000 × g-nél (4°C) 2 percig jégfürdőben homogenizáltuk. A sejteket 20 percig centrifugáltuk (2500 × g, 4°C), és a felülúszót kétszer mostuk desztillált vízzel. Ezután 110°C-on 6 N HCl-t adtunk hozzá teljesen az elején, és 16 órán keresztül reagáltunk. A reakció befejezését követően toluolhoz (3 ml) adtuk, és az elegyet 20 percig kevertettük. A 10 percig tartó centrifugálást (3000 × g, 20°C) követően a szerves réteget összegyűjtöttük, és p-dimetilaminobenzaldehidet adtunk hozzá. 560 nm-en a mintában lévő hidroxiprolint többlemezes spektrométerrel (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) detektáltuk.

A hidroxiprolin mérése a májban HPLC-vel

A bal tüdőt eltávolítottuk, lemértük (~0,3 g) és 5 ml etanolban cellahomogenizátorral (Eilard) 8000 × g-nél (4°C) 2 percig jégfürdőben homogenizáltuk. A homogenátumot 20 percig centrifugáltuk (2500 × g, 4°C), és a felülúszót összegyűjtöttük. A kapott folyadékot (1 ml) 8 órán keresztül 60°C-on szárazra hevítettük. Miután a maradékot 40 μl etanolban és 80 μl borátpufferben (0,1 M, pH 8) feloldottuk, 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazánt (100 mM) adtunk hozzá fluoreszcens reagensként. A reakciót szobahőmérsékleten 15 órán át sötétben hagytuk folytatódni. Ezután 840 μl sósavat (6 mol/l) adtunk a reakció befejezéséhez. A 20 percig tartó centrifugálást (2500 × g, 20°C) követően a felülúszót eltávolítottuk a HPLC-analízishez.

A Hitachi L6000 HPLC rendszert (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) használtuk.A kimutatás Hitachi L7480 fluoreszcens spektrométerrel történt (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokió, Japán;gerjesztés 475 nm-en, emisszió 530 nm-en). Az oszlop (HitachiHigh-Technologies Corporation) egy YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) volt szobahőmérsékleten. A mobil fázis acetonitril:víz(35:65-50:50 gradiens 15 perc alatt) volt, az áramlási sebesség 1ml/perc.

A hidroxiprolin mérése a tüdő- és májszervezetben LC-MS segítségével

A bal tüdőt eltávolítottuk, megmértük (~0.3 g) és 5%-os triklór-ecetsav oldatban (x10 térfogat) cellahomogenizátorral (Eilard) 8000 × g-nél (4°C) 2 percig jégfürdőben homogenizáltuk. A sejteket 20 percig centrifugáltuk (2500 × g, 4°C). A felülúszót kétszer mostuk desztillált vízzel. Ezután 6 N HCl-t adtunk hozzá 110°C-on 16 órán keresztül, és a mintákat előkészítettük a méréshez. A májat eltávolítottuk, megmértük (~0,3 g) és 5 ml etanolban cellahomogenizátorral (Eilard) 8000 × g-nél (4°C) 2 percig jégfürdőben homogenizáltuk. A homogenátumot 20 percig centrifugáltuk (2500 × g, 4°C), a felülúszót összegyűjtöttük, és a mintákat előkészítettük a méréshez.

A hidroxiprolin koncentrációját LC-MS módszerrel, LC-MS2020 rendszerrel (Shimadzu Corp., Kyoto, Japán) határoztuk meg. Az LC tekintetében a mobil fázis 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4 volt. Az oszlop Shin-pack VP-ODS (150×2 mm átmérőjű) volt. Az áramlási sebesség 0,2 ml/perc volt. Az MS tekintetében atmoszférikus kémiai ionizációt (APCI) alkalmaztunk. Pozitív ion detektálást is alkalmaztunk. A szondaelektronfeszültség 4,5 kV, a szondaáram 4,2 μA volt. Az APCI szonda hőmérséklete 250 °C volt, a hajlított deszolvációs vonal (CDL) elektronfeszültsége pedig -30,0 V volt. A CDL hőmérséklete 250 °C és a blokk hőmérséklete 20 °C volt. A Q-táblák 1, 2 és 3 előfeszítése 5,0, 25,0 és 35,0 V volt. A Q-tábla RF elektronfeszültsége 150,0 V volt.

Statisztikai elemzés

A csoportok közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel vizsgáltuk. Ha nem volt szignifikáns különbség, a csoportok közötti különbséget a Bonferroni-módszerrel vizsgálták. A korrelációkat kétoldalas t-teszttel vizsgálták. A P<0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikáns különbségnek.

Eredmények

A hidroxiprolinkoncentráció mérése LC-MS módszerrel

A hidroxiprolinMS kromatogramja

A hidroxiprolin tömegspektrumát a 2. ábra mutatja. A hidroxiprolinsztenderd (80 pg/ml) MS-je 173,0 molekulatömegű fragmentcsúcsokat eredményezett (molekulaion + ecetsav-víz), amelyek az ionmolekulák számának (molekulatömeg, 131,15) és az ionerősség növelésére szolgáló ecetsav-ammónium hozzáadásából keletkeztek.

A hidroxiprolin

LC-MS kromatogramja

Az LC körülmények a következők voltak: Mozgófázis, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; oszlop,Shin-pack VP-ODS (150×2 mm átmérőjű); áramlási sebesség, 0,2 ml/perc és ultraibolya (UV) detektálás 230 nm-en. Az MS-t azAPCI ionizációs módszerrel végeztük, és az ionérzékelés pozitív volt.

A hidroxiprolin LC-MS-szelektált ionmonitorozás (SIM) kromatogramja (m/z, 173,0) a 3. ábrán látható. Ahogyan a hidroxiprolinszabványnál megfigyeltük, 1 ng/ml-nél egy csúcsot figyeltünk meg 2,213 perces retenciós idővel. Éles csúcsot figyeltünk meg 50 ng/ml-nél is. Az LC-UV spektrumban (230 nm) 1 μg/ml-nél, ami a standard koncentráció 1000-szerese volt, egy kis csúcsot észleltünk.

A hidroxiprolin LC-MS kimutatásának érzékenysége

A hidroxiprolin LC-MS-SIM standard görbéje (m/z, 173,0; molekulaion + ecetsav-víz) a 4. ábrán látható. A csúcsterület-módszert alkalmazva a standardgörbéhez a hidroxiprolin éles csúcsot mutatott 35ng/ml-nél (3. ábra). A <35 ng/ml koncentrációknál azonban nem volt megfigyelhető korreláció a csúcsterületek között. 35-560 ng/ml között a csúcsterületek között korreláció volt megfigyelhető, és a standard görbe egyenes vonal volt. 60 és80 μg/ml-nél a csúcsterületek majdnem azonosak voltak. >60 μg/ml koncentrációknál nem volt megfigyelhető korreláció a csúcsterületek között.

A hidroxiprolinLC-MS kromatogramja és MS spektruma a tüdő- és májfibrózis modelljében patkányokban

Az 5. ábra a hidroxiprolin (m/z 173,0; molekulaion + ecetsav-víz) LC-MS kromatogramját és MS spektrumát mutatja SIM detektálással a fibrózis tüdőmodelljében patkányokban. A tüdő LC-MSch-kromatogramjában, a hidroxiprolinstandardhoz hasonlóan, egy határozott csúcs volt megfigyelhető az m/z 173,0-nál, 2,213 perces tartózkodási idő mellett. A tömegspektrumban a hidroxiprolint atm/z 131,15 azonosították.

A 6. ábra szemlélteti az LC-MS kromatogramot és az MS spektrumot a hidroxiprolin (m/z 173,0; molekulaion + ecetsav-víz) SIM kimutatásával a patkányok fibrotikus májszövetében. Ahogy a hidroxiprolin standard esetében megfigyeltük, az LC-MS kromatogramban és az MS spektrumban 2,213 perces retenciós időnél egy csúcsot észleltünk.

Hidroxiprolin koncentráció a tüdőszövetben (kolorimetrikus és LC-MS módszerek)

A patkányok tüdőszövetében a hidroxiprolin koncentrációjának meghatározására alkalmazott kolorimetrikus és LC-MS módszereket a 7. ábra hasonlítja össze.Minden oszlop kilenc kísérlet átlaga ± standard eltérés. A kolorimetriás módszer szerint a patkánytüdőszövet hidroxiprolin-koncentrációja a BLM-infúziós csoportban (652,3±70,0 μg/bal tüdő) szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollcsoportban (547,1±52,3 μg/bal tüdő;P<0,05). Az LC-MS módszer szerint a BLM-infundált csoportban(610,9±50,3 μg/bal tüdő) szignifikánsan magasabb volt az érték a kontrollcsoporthoz képest (493,3±53,5 μg/bal tüdő; P<0,05).Az LC-MS módszerrel mért hidroxiprolin-koncentráció a patkánytüdőszövetben azonban alacsonyabb értéket mutatott, mint a kolorimetriás módszerrel mért érték.

A patkánytüdőszövetben kolorimetriás és LC-MS módszerrel mért hidroxiprolin-koncentrációkat a 8. ábra hasonlítja össze. A kontrollcsoport tüdőszövetében a hidroxiprolin koncentrációjának meghatározásakor a kolorimetriás és az LC-MS módszer között korreláció mutatkozott (r=0,972). Hasonlóképpen, a BLM-infúziós csoport tüdőszövetében a hidroxiprolin koncentrációjának meghatározására szolgáló kolorimetriás és LC-MS módszerek között is korrelációt állapítottunk meg (r=0,918).

Hidroxiprolin koncentráció meghatározása patkányok májszövetében fluoreszcens jelöléssel és LC-MS módszerekkel

A patkányok májszövetében a hidroxiprolin koncentrációjának fluoreszcens jelöléssel és LC-MS módszerekkel történő értékelését a 9. ábra szemlélteti. A fluoreszcens jelölési módszer szerint a DMN-infundált csoport patkánymájszövetében a hidroxiprolin-koncentráció (105,4±36,5 μg/g) szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollcsoportban (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). AzLC-MS elemzés szerint is a DMN-infundált csoport (190,4±70,3 μg/g)szignifikánsan magasabb értéket mutatott a kontrollcsoporthoz képest (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Az LC-MS módszerrel mért hidroxiprolinkoncentráció a patkánymájszövetben azonban magasabb volt, mint a fluoreszcens jelölési módszerrel mért koncentráció.

A patkánymájszövetben fluoreszcens jelölési és LC-MS módszerrel mért hidroxiprolinkoncentráció a 10. ábrán korrelált. A kontrollcsoport májszövetében fluoreszcens jelöléssel mért hidroxiprolin-koncentráció korrelált az LC-MS módszerrel kapott értékkel (r=0,957). A DMN-infundált csoport májszövetében a fluoreszcens jelölési módszerrel kapott hidroxiprolin-koncentráció szintén korrelált az LC-MS módszerrel kapott koncentrációval (r=0,981).

Diszkusszió

A hidroxiprolin egy aminosavtípus, amely az albuminban található. A fehérjében lévő prolinmaradványt a4-monooxgenáz hidroxilálja 4-hidroxi-2-oxoglutálsavvá, amely a 4-glutaminsavval alaninná és glicinné alakul át az emberi szervezetben. A test minden belső szervében a gyulladás és a fibrózis az extracelluláris mátrix (ECM) összetevőinek felhalmozódását eredményezheti (12).Kóros körülmények között azonban további fibrózis alakulhat ki a májban, a tüdőben és a vesében (13,14).A krónikus hepatitis és a májszklerózis fibrózissal jár, és szoros összefüggést mutat a májrákkal is (15).

A tüdőben a fibrózis súlyossága a tüdőgyulladás típusától függ (16).Általában a tüdőfibrózis intersticiális tüdőgyulladást kísér(17). A belső szervekben a fibrózist a myofibroblasztok által lerakódott ECM komponensek proliferációja okozza. A fibrózis kialakulásának megértéséhez a kollagénkoncentráció vizsgálata szükséges. A hidroxiprolin-koncentráció a kollagénhez társul, ami a fibrózis mértékének indikátora (18-20). A hidroxiprolin fontos a kollagénproliferáció (mint az infibrózis) és az anyagcsere működési zavarai által okozott betegség mutatójaként.

Az utóbbi években az LC-MS bizonyítottan rendkívül érzékeny kimutatási módszer (7,8,21).Az LC-MS egy LC és egy MS komponensből, valamint az ezeket összekötő interfészből áll. Az LC-rész megegyezik a hagyományos HPLC-vel. A mintát a határfelületi rész ionizálja. A termospray ionizáció instabil (illékony) termékeket eredményezett, ezért APCI-t használtak (amely az anyagot ionizálja, de az oldószert nem, a légköri nyomáson lévő oldószerrel történő porlasztást követően). Az elektrospray-ionizáció (ESI)nagy polaritású és nagy molekulatömegű molekulák ionizálására használható, ami ideálisan alkalmas a határfelületi komponensre.jelen vizsgálatban azonban az ESI-t nem alkalmazták a testminták hidroxiprolinjának témamérésére, mivel az ESI-t nem kísérte a termospray ionizáció esetén. Egyszerűbb eljárás volt a hidroxiprolin Na+ -val kombinált mérése a minta további Na+ hozzáadásával.

A hidroxiprolin MS spektruma az m/z 173,0 és 131,15 csúcsokat mutatta. Az m/z 173,0 csúcsot a mozgó fázishoz az ionerősség növelése érdekében hozzáadott ecetsav-ammóniumból származó ecetsav-sót képviselő csúcsként azonosították. Továbbá, mivel az m/z 131,15 és 173,0 összehasonlító erőssége az MS-spektrumban közel azonos, az m/z 173,0 iont választotta ki a SIM az MS-kromatogramban a mobilfázis interferenciacsúcsának elkerülése érdekében.

A hidroxiprolin-standard 1 ng/ml-es MS-kromatogramjában a SIM-mérés során egy m/z 173,0-ás csúcsot figyeltek meg. Az 1 μg/ml-es hidroxiprolin UV spektrumában (230 nm), amely a standardkoncentráció 1000-szerese volt, egy kis csúcs volt megfigyelhető (a mérést az LC méréssel egy időben végezték).

<35 ng/ml koncentrációnál a csúcsok között nem volt erős korreláció a különböző módszerek között, és nem lehetett standardgörbét készíteni. Feltételeztük, hogy az analitot befolyásolhatta a mobilfázis csúcsa, mivel a hidroxiprolin viszonylag kis molekulatömegű (131,15). Ezenkívül a csúcs retenciós ideje alacsony koncentrációknál (hidroxiprolin koncentráció <35 ng/ml) az oldószer polaritása miatt instabillá válhatott.

Feltételezték, hogy az anyagok koncentrációjának mérése akár a pg/ml szintig is lehetséges. Az MS kromatogramban a hidroxiprolin csúcsa esetében a retenciós idő rövid volt (2,213 perc). A hidroxiprolin ODS-oszlopon való megtartásának képessége gyengébb volt az eredetileg javasoltnál.Az MS spektrumban az m/z 131,15 és 173,0 relatív ionerősség megközelítőleg azonos volt, és ennek megfelelően a mobilfázis interferenciacsúcsa az m/z173,0 iont választotta. A tüdő- és májszövetben lévő hidroxiprolin LC-MS kromatogramján éles, m/z 173,0 csúcsot figyeltek meg 2,213 perces tartózkodási időnél, ugyanúgy, mint a hidroxiprolin-standard esetében. Az MS spektrumot tekintve a hidroxiprolin molekulaion-csúcsa (m/z 131,15) megerősítést nyert.

A hidroxiprolin koncentrációjának LC-MS-sel történő mérése a tüdő- és májszövetekben összehasonlításra került a csoportunk korábbi tanulmányából származó kolorimetriás módszerrel, valamint HPLC-vel végzett fluoreszcens módszerrel kapott értékekkel. Rendkívül szignifikáns pozitív korrelációt figyeltek meg. A tüdőben a kolorimetriás módszerrel kapott hidroxiprolin-koncentráció értéke azonban magasabb volt, mint az LC-MS módszerrel kapott érték. Továbbá a májban a fluoreszcens módszerrel kapott hidroxiprolinkoncentráció a HPLC alkalmazásával alacsonyabb volt az LC-MS-sel kapott értékhez képest (amely feltételezhetően a mintában lévő összes komponens magas abszorbanciáját jelentette 560 nm-es állandó hullámhosszon).

Összefoglalva, a hidroxiprolint, mint a fibrosis indikátorát, csoportunk korábbi tanulmányaiban kolorimetriás és HPLC módszerrel mérték. Összehasonlításképpen a jelen tanulmány megállapította, hogy az LC-MS módszer előnyösebb, amelyet az egyszerű eljárás, a nagy érzékenység (pg-szint) és a rövid elválasztási idő jellemez. További, nagyobb mintaszámú vizsgálatok indokoltak ezen eredmények megerősítésére.

Köszönet

A szerzők köszönetet mondanak M. Kusunose, M. Ono ésA. Hamadának (Gyógyszerészeti Tanszék, Kochi Medical School, Kochi, Japán) a vizsgálatban használt számos reagens biztosításáért, a hasznos tanácsokért és a technikai szakértelemért. Ezt a munkát a kínai Heilongjiang tartomány közegészségügyi minisztériuma (no. 2013365) támogatta.

	Kitchener RL és Grunden AM: Prolidasefunction in proline metabolism and its medical and biotechnologicalapplications. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.Cikk megtekintése : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H és MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M és Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. Cikk megtekintése: Google Scholar
	Jemal M és Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G és Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al: LC-MS alapú metabolomika a klinikai laboratóriumban. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al: Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Cikk megtekintése : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al: Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(In Japanese).
	Muiznieks LD és Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM és Werb Z: Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR és Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM és Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ and Brown KK: Acuteinterstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in relation tohe changes in hydroxyproline and retinoid levels of the liver inrats. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. View Article : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al: Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R és Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.