Bacterial strains and growth conditions

Bacterial strains are listed in Supplementary Table 2. Az Escherichia coli baktériumokat Luria Broth (LB) lemezeken vagy folyékony LB táptalajon tenyésztettük, 200 µg ml-1 eritromicinnel kiegészítve, 37 °C-on. Az E. coli transzformációját plazmid DNS-sel kémiailag kompetens sejtekkel végeztük. A S. pneumoniae 2. D39 szerotípusát és a 4. TIGR4 szerotípusát, valamint izogén mutánsaikat Columbia blood agar lemezeken (Oxoid) termesztettük, amelyek eritromicint (5 µg ml-1) és/vagy klóramfenikolt (5 µg ml-1) tartalmaztak, vagy 0,5% élesztőkivonattal (THY; Roth) vagy kémiailag meghatározott táptalajon (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences) kiegészített Todd-Hewitt táptalajon tenyésztettük. A pneumococcusok tenyésztését vér-agaron vagy folyadéktenyészetben 37 °C-on és 5% CO2 mellett, keverés nélkül végeztük.

Mutánsok előállítása

A D39 és TIGR4 pneumococcus tacL mutánsok előállításához egy olyan DNS fragmentumot használtunk, amely az S. pneumoniae D39 spd_1672 génből és annak felfelé és lefelé flankáló régióiból állt, PCR-rel amplifikáltuk genomiális DNS-ből az SPD1672_OLup_for és SPD1672_OLdwn_rev primerek segítségével (a primerek a 2. kiegészítő táblázatban találhatók). A tisztított PCR-termékeket klónoztuk a pUC18-ba, és E. coli DH5α kémiailag kompetens sejteket transzformáltunk az így kapott plazmiddal. A kívánt DNS-beillesztést tartalmazó rekombináns pNH1 plazmidot megtisztítottuk, és templátként használtuk az InvrevKpnISPD1672 és InvforPstISPD1672 primerekkel végzett inverz PCR-reakcióhoz. A deletált génszekvenciát egy ermB génnel helyettesítettük, amelyet PCR-rel amplifikáltunk a pTP1 vektorból az InvrevKpnIErm és InforPstIErm primerrel. A kész rekombináns plazmidot pneumococcusok transzformálására és mutagenizálására használtuk. A transzformáció hatékonyságát a végleges rekombináns plazmid és egy másik géndeléciós plazmid (a cbpL gén deléciójára) segítségével értékeltük S. pneumoniae D39Δcps 44-ben. Figyelemre méltó módon a transzformációs hatékonyság ezáltal jelentősen megnőtt a tacL deléció esetében (2,8 telep per ng plazmid a cbpL esetében vs. 29,8 telep per ng plazmid a tacL esetében).

Az izogén mutánsokat pBAV1CpE alapú in transz rendszerrel egészítettük ki; a pBAV1CpE-t a pBAV1K-T5-gfp45-ből módosítottuk, a kanamicin-rezisztencia gént klóramfenikol-rezisztencia génre, a T5 promótert pedig a riboszómakötő helyet és startkódont tartalmazó eritromicin promóter régióra (pE) cserélve. A teljes spd_1672 gént PCR-rel amplifikáltuk az 1672_com_for és Spd1672_com_rev primer segítségével, és a tisztított fragmentumot klónoztuk a pBAV1CpE-be. Az így kapott pBAV-tacL plazmidot izogén tacL mutánsok transzformálására használtuk. A tacL delécióját, valamint az in trans komplementációt qRT-PCR segítségével igazoltuk (3. kiegészítő ábra).

Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)

A D39 vad típusú törzset, a tacL-hiányos mutánst és a komplementált mutánst THY-ban termesztettük a log fázis közepéig (A 600 = 0,35-0,45), majd az EURx GeneMatrix Universal RNS tisztító kit (roboklon) segítségével RNS izoláláshoz betakarítottuk. Az RNS minőségét agarózgél-elektroforézissel és standard PCR-rel ellenőriztük az EnoRT_F és EnoRT_R primer használatával (lásd a 2. kiegészítő táblázatot). A cDNS szintézisét SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) és hexameric_random primerek (GE Healthcare) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint. A cDNS minőségét PCR segítségével ellenőriztük az EnoRT_F és EnoRT_R primer használatával, a koncentrációt pedig nanodrop segítségével mértük. A cDNS-t további vizsgálatokig -20 °C-on tároltuk. A qRT-PCR-kísérletekhez StepOnePlusTM Real-Time PCR rendszert (Applied Biosystems) és SYBR® Green Master Mixet (Biorad) használtunk tacL-specifikus primerekkel, valamint kontrollként enoláz-primerekkel kombinálva (lásd a 2. kiegészítő táblázatot). Az adatok elemzéséhez a StepOne szoftvert (v. 2.3, Life Technologies) használtuk. A végleges eredményeket a fluoreszcencia nagysága (ΔRn) és a PCR-ciklusszámok függvényében ábrázoltuk.

Szekvenálás és bioinformatikai elemzés

Szekvenálás: 1 ng tisztított kromoszómális DNS S. pneumoniae törzsek D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603) DNS-éből, és TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) segítségével és az Illumina Nextera© XT DNS Library Prep Kit-et követve egyedi könyvtárakat készítettünk. Egy Agilent Technology 2100 Bioanalyzer szolgált a címkézés és a végleges könyvtár fragmensméret-eloszlásának ellenőrzésére egy nagy érzékenységű DNS-chipen. A DNS-könyvtár tisztításához AMPure XP gyöngyöket használtunk. A végleges összevont könyvtárat egy MiSeq Reagent v3 600 cycle kitre vittük fel, és egy MiSeq rendszeren szekvenáltuk 300 ciklusos párosított végű futásként. A végleges könyvtár pool-t 5% PhiX kontrollkönyvtárral spicceltük. 847 ± 25 (K mm-2) klasztersűrűséget értünk el, a klaszterek 96,46 ± 1,48%-a megfelelt a szűrési előírásoknak. A 21,1 millió olvasatból 20,3 millió olvasat (94,7%) ment át a szűrési előírásokon, ami 12,52 Gbp szekvenciaadatot eredményezett. Az indexolvasatok egyenletesen oszlottak el a hat egyedi minta között. A generált FASTQ fájlokat további bioinformatikai elemzésnek vetettük alá az alábbiak szerint.

SNP detektálás és annotálás: SNP-detektálást végeztünk az S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL esetében egyenként a “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; paraméter: minimális rész a variáns bizonyításához: 60%; a variáns hely minimális lefedettsége: ≥5 szekvencia leolvasása). Referencia genomként a Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) vagy a Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) genomot használtuk.

A mutánsok egyes csoportjaira (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) és (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) kapott SNP-ket összevontuk és összehasonlítottuk. A genom lefedettségét a qualimap46 segítségével becsültük meg, ugyanazokat a referencia genomokat használva, mint az SNP-k kimutatásához.

Pneumococcus teichoic acidok izolálása

LTA kivonása és izolálása: Az LTA tisztítását alapvetően a máshol7 leírtak szerint végeztük, de a pnLTA hozamának optimalizálása érdekében egy konkrét részletet módosítottunk. A pneumococcus sejteket citrát pufferben (50 mM, pH 4,7) reszuszpendáltuk és háromszor bontottuk fel francia préssel (Constant Cell Disruption System, Serial No. 1020) 10 °C-on, 20 kPSI nyomáson. Az egyesített felülúszókhoz 4%-os végső koncentrációban SDS-t adtunk. Az oldatot 30 percig inkubáltuk 100 °C-on, majd ezt követően egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertettük. Az oldatot 30 000 × g-n 15 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A pelletet négyszer mostuk citrát pufferrel a fenti centrifugálási feltételek mellett. Az egyesített LTA-tartalmú felülúszókat és a kapott üledéket, amely a nyers PGN-WTA-komplexet tartalmazta, külön liofilizáltuk. Az így kapott szilárd anyagokat mindkettőt ötször mostuk etanollal (centrifugálás: 20 perc, 20 °C, 10 650×g) az SDS eltávolítása érdekében, majd liofilizáltuk (így kaptuk az LTA-t tartalmazó A pelletet és a PGN-WTA-komplexet tartalmazó B pelletet). Az LTA izolálásához az A pelletet citrát pufferben reszuszpendáltuk, és szobahőmérsékleten, erőteljes keverés mellett azonos mennyiségű bután-1-ollal (Merck) extraháltuk. A fázisokat 2100×g-nél 4 °C-on 15 percig tartó, 2100×g-nél végzett centrifugálással választottuk el. A vizes fázist (amely az LTA-t tartalmazta) összegyűjtöttük, és az extrakciós eljárást kétszer megismételtük a szerves fázissal és az interfázissal. Az egyesített vizes fázisokat liofilizáltuk, majd 5 napig 4 °C-on 50 mM ammónium-acetát pufferrel (pH 4,7; 3,5 kDa cutoff membrán) dializáltuk; a puffert 24 óránként cseréltük. Az így kapott nyers LTA-t hidrofób kölcsönhatás kromatográfiával (HIC) tisztítottuk tovább HiPrep Octyl-Sepharose oszlopon (GE Healthcare; 16 × 100 mm, ágytérfogat 20 ml). A nyers LTA anyagot a lehető legkevesebb kiindulási pufferben (15% propan-1-ol (Roth) 0,1 M ammónium-acetátban (pH 4,7)) oldottuk fel, majd szobahőmérsékleten 13 000×g-nél 5 percig centrifugáltuk, és a kapott felülúszót liofilizáltuk. Az LTA-t tartalmazó pelletet 30 mg ml-1 koncentrációban oldottuk fel a HIC kiindulási pufferben, és HIC segítségével tisztítottuk meg, 15-60% propan-1-ol (Roth) 0,1 M ammónium-acetátban (pH 4,7) lévő lineáris gradiens segítségével. Az LTA-tartalmú frakciókat fotometrikus foszfátteszttel47 azonosítottuk. A foszfáttartalmú frakciókat egyesítettük, liofilizáltuk és fagyasztva szárítás után vízzel mostuk a maradék puffer eltávolítása érdekében.

WTA kivonása és izolálása: A WTA izolálását és kivonását a máshol11 leírtak szerint végeztük, de kisebb módosításokkal. Az LTA izolálása során keletkezett (a nyers PGN-WTA komplexet tartalmazó) B sejtet 10 mg ml-1 koncentrációban 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM MgSO4-ot tartalmazó 100 mM Tris-HCl-ban (pH 7,5) reszuszpendáltuk. DNáz A-t és RNáz I-t adtunk hozzá 10, illetve 50 µg ml-1 végső koncentrációban. A szuszpenziót 2 órán át kevertettük 37 °C-on. Ezt követően 10 mM CaCl2-t és tripszint (100 µg ml-1) adtunk hozzá, majd a keverést egy éjszakán át 37 °C-on folytattuk. Az enzimek inaktiválása érdekében 1%-os végkoncentrációjú SDS-t adtunk hozzá, majd az elegyet 15 percig inkubáltuk 80 °C-on. A sejtfalat 25 °C-on 45 percig 130 000×g-nél 130 000×g centrifugálással nyertük ki. Az így kapott pelletet 1 ml eredetileg használt Tris-HCl oldathoz 0,8 ml 8 M LiCl-ben reszuszpendáltuk, és 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. Egy újabb centrifugálást követően a fentiekkel azonos feltételek mellett a pelletet 1 ml 10 mM etiléndiamintetraecetsavban (EDTA, pH 7,0) reszuszpendáltuk az eredetileg használt Tris-HCl oldat per ml-ében, és ezt a mintát 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. A pelletet kétszer mostuk vízzel. Végül a pelletet 2-4 ml vízben reszuszpendáltuk és liofilizáltuk, így kaptuk a tisztított PGN-WTA komplexet. A konkrét kutatási kérdéstől függően ezt követően további kémiai vagy enzimatikus kezeléseket végeztünk.

Kémiai és enzimatikus kezelések

Az LTA hidrazinos kezelése: A tisztított LTA-t 5 µg µl-1 koncentrációban vízmentes hidrazinban (N2H4; ICN Biomedicals) oldottuk, majd 1 órán át 37 °C-on kevergetve inkubáltuk. A reakciót ugyanekkora mennyiségű aceton hozzáadásával oltottuk, majd nitrogénáram alatt szárítottuk; a szárítási lépést kétszer megismételtük. Ezt követően a nyers de-O-acilált LTA-t gélpermeációs kromatográfiával (GPC) tisztítottuk Bio-Gel P-10-en (45-90 µm, BioRad; oszlopméret: 1,5 × 120 cm; puffer): (150 mM ammónium-acetát (pH 4,7)) oszlop.

A PGN-WTA komplex enzimatikus emésztése: A PGN összes aminosavának eltávolítása érdekében a PGN-WTA komplexet 50 mM Tris-HCl-ban (pH 7,0; 10 mg ml-1) oldottuk és a pneumococcus LytA amidázzal kezeltük a máshol leírtak szerint11. A rekombináns His-taggal jelölt LytA amidázt (10 µg LytA per mg) három aliquotában adtuk hozzá 0, 24 és 48 óra elteltével, így az inkubáció teljes időtartama 72 óra volt 37 °C-on. Ezt követően az enzimet 5 perces 100 °C-on történő forralással inaktiváltuk. Centrifugálás (25 000×g, 15 perc, 20 °C) után a felülúszót összegyűjtöttük és liofilizáltuk. A nyers LytA kezelt PGN-WTA komplexet GPC-vel tovább tisztítottuk Bio-Gel P-30-on (45-90 µm, BioRad; oszlopméret: 1,5 × 120 cm; puffer: 150 mM ammónium-acetát (pH 4,7)) oszlop. A kapott nagy molekulatömegű anyagot (~12 mg) tovább emésztettük lizozimmal (200 µg; Sigma) és mutanolizinnel (200 µg; Sigma) 800 µl nátrium-foszfátot (20 mM; pH 4,8) és nátrium-azidot (0,02%) tartalmazó reakcióelegyben 37 °C-on egy éjszakán át. Az enzimeket 5 percig 100 °C-on történő melegítéssel inaktiváltuk. Az oldható anyagot centrifugálással (18 000×g, 10 perc, 20 °C) nyertük ki és liofilizáltuk. A kis PGN fragmentumokhoz kötött pnWTA izolálása végső GPC-vel történt a fent említett feltételek mellett.

NMR spektroszkópia

NMR spektroszkópiai méréseket végeztünk D2O-ban 300 K-en Bruker AvanceIII 700 MHz-es készülékkel (inverz 5 mm-es négyszeres rezonanciájú Z-grad krioszondával felszerelve). A deuterált oldószereket a Deutero GmbH-tól (Kastellaun, Németország) vásároltuk. Az 1H (δH 2,225) és 13C (δC 30,89) NMR spektrumok kalibrálásához külső standardként acetont használtunk. A 31P NMR-spektrumokat (δP 0,0) külső standardként 85%-os foszforsavval D2O-ban kalibráltuk. Az 1H NMR hozzárendeléseket kétdimenziós 1H, 1H COSY és TOCSY kísérletekkel erősítettük meg, a 13C NMR hozzárendeléseket pedig kétdimenziós 1H, 13C HSQC-vel jeleztük az 1H NMR hozzárendelések alapján. Az interreziduális kapcsolódást és a 13C hozzárendelés további bizonyítékát kétdimenziós 1H, 13C HMBC és 1H, 13C HSQC-TOCSY kísérletekből nyertük. A foszfátcsoportok kapcsolódását kétdimenziós 1H, 31P HMQC és 1H, 31P HMQC-TOCSY segítségével határoztuk meg. Minden adatot a Bruker TOPSIN V 3.0 vagy magasabb verziószámú programmal szereztünk be és dolgoztunk fel.

Masszaspektrometria

A kis PGN fragmentumokhoz kötött pnWTA elemzésére elektrospray ionizációs Fourier-transzformációs ionciklotron-rezonancia tömegspektrometriát (ESI-FT-ICR-MS) végeztünk 7 Tesla APEX Qe műszerrel (Bruker Daltonics, Bréma, Németország) negatív ion módban, víz/propan-2-ol/7 M trietilamin/ecetsav keverék (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v/v) oldószerrel, a korábban leírtak szerint6. A hidrazin kezelt LTA MS-analízisét Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bréma, Németország) készülékkel végeztük negatív ion módban, ugyanezt az oldószert használva. Egy Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) ionforrást használtunk -1,1 kV-ra beállított permetezési feszültséggel. A tömegskálát külsőleg kalibráltuk ismert szerkezetű glikolipidekkel, és minden spektrumot töltésmentesítettünk. A megadott tömegszámok a semleges molekulák monoisotópos tömegére vonatkoznak.

Elektronmikroszkópia

Field emission scanning electron microscopy: A baktériumokat 5%-os formaldehiddel és 2,5%-os glutaraldehiddel 1 órán át jégen rögzítettük a táptalajban, majd HEPES pufferrel (HEPES 0,1 M, 0,09 M szacharóz, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9) mostuk. A rögzített baktériumoldatból egy 50 µl-es aliquotát poli-l-lizin bevonatú fedőlapokra helyeztünk, és 10 percig hagytuk ülepedni. A 2%-os glutaraldehiddel PBS-ben 5 percig szobahőmérsékleten történő fixálás után a fedőlemezeket TE-pufferrel (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) mostuk, majd minden lépésnél 10 percig jégen, fokozatos aceton-sorozatban (10, 30, 50, 70, 90 és 100%) dehidratáltuk. A 100%-os acetonos lépésben a mintákat hagytuk, hogy elérjék a szobahőmérsékletet, mielőtt ismét 100%-os acetonba váltottunk, majd folyékony CO2-vel (CPD 30, Balzers, Liechtenstein) kritikus ponton szárítottuk őket. A szárított mintákat porlasztásos bevonással (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) palládium-arany filmmel fedtük be, mielőtt a Zeiss Merlin (Oberkochen, Németország) téremissziós pásztázó elektronmikroszkópban a HESE2 Everhart Thornley SE detektor és az in-lens SE detektor segítségével 25:75 arányban, 5 kV gyorsítófeszültség mellett megvizsgáltuk.

Transzmissziós elektronmikroszkópia: a baktériumokat a fentiek szerint fixáltuk, majd ozmiumtetroxiddal (1% HEPES pufferben) 1 órán át szobahőmérsékleten tovább fixáltuk. HEPES pufferrel történő mosás után a mintákat 10, 30 és 50%-os acetonnal dehidratáltuk jégen, majd 70%-os acetonban, 2%-os uranil-acetáttal inkubáltuk egy éjszakán át 7 °C-on. A mintákat tovább dehidratáltuk 90 és 100%-os acetonnal jégen, hagytuk, hogy elérjék a szobahőmérsékletet, és tovább dehidratáltuk 100%-os acetonnal, majd 100%-os etanolba váltottuk. Ezt követően a mintákat LRWhite aromás akrilgyantával infiltráltuk. A 2 napig 50 °C-on történő polimerizáció után gyémántkéssel ultravékony metszeteket vágtunk, amelyeket butvarral bevont 3000 mesh rácsra gyűjtöttünk, majd 4%-os vizes uranil-acetáttal 3 percig ellenfestettük. A mintákat egy Zeiss TEM 910-es készülékben 80 kV-os gyorsítófeszültségen és kalibrált nagyításon képeztük le.

A kontrasztot és a fényerőt az Adobe Photoshop CS3 programmal állítottuk be.

Az antitestek előállítása

Az elemzett CBP-k elleni poliklonális antitesteket egerekben neveltük rutin immunizációs protokollok alkalmazásával. Röviden, CD-1 egereket intraperitoneálisan immunizáltunk 20 µg rekombináns fehérjével és Freund nem teljes adjuvánssal (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) (50:50 v/v). A 14. és 28. napon az egereket 20 µg fehérjével és Freund nem teljes adjuvánssal (50:50 v/v) erősítették. Az egereket a 42. napon kivéreztettük, és a poliklonális IgG-t protein A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) segítségével tisztítottuk a szérumból. Az antitesteket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Flow-citometria

Az S. pneumoniae D39 vad típusát, izogén tacL mutánsát és a komplementált mutánst THY közegben tenyésztettük a log fázis közepéig, majd 6 percig 3275×g-nél arattuk le, és PBS-szel (pH 7,4) mostuk. A kapszulatartalom számszerűsítéséhez 4 × 108 baktériumot tartalmazó 100 µl szuszpenziót inkubáltunk anti-kapszuláris poliszacharid antiszérával (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 PBS-ben) 30-45 percig 37 °C-on és 5% CO2-on 96 lyukú lemezekben (U-bottom, Greiner Bio-One). A mosást követően a mintákat másodlagos kecske antinyúl IgG-vel kapcsolt Alexa488-jelzett antitesttel (Invitrogen) inkubáltuk (1:500 PBS-ben, 30-45 perc, 37 °C). A PBS-sel történő mosást követően a baktériumokat 1%-os formaldehiddel fixáltuk egy éjszakán át 4 °C-on.

A CBP-k mennyiségét, valamint a teichonsavak mennyiségét a nem kapszulázott D39 vad típusú, mutáns és komplementált törzsekben áramlási citometriával mértük, miután 1%-os formaldehiddel 1 órán át 4 °C-on fixáltuk. Kétszáz µl, 8 × 108 baktériumot tartalmazó szuszpenziót inkubáltunk különböző CBP-k elleni specifikus poliklonális antitestekkel (1:500 PBS-ben), illetve a TA-k mennyiségi meghatározásához P-Cho (TEPC-15) vagy Forssman antigén elleni antitestekkel (15 perc 37 °C-on és 5% CO2-on) 96 lyukú lemezekben (U-bottom, Greiner Bio-One). Mosás után a mintákat másodlagos kecske anti-IgG-vel kapcsolt Alexa488-jelölt Alexa488 antitesttel (Invitrogen) inkubáltuk (15 perc, 37 °C). A fluoreszcenciát FACS Calibur™ (BD Biosciences) segítségével határoztuk meg.

Immunoblot analízis

A S. pneumoniae D39-et, annak izogén tacL mutánsát és a komplementált mutánst THY táptalajon neveltük, amíg a 0,35-0,45 A 600 értéket el nem érték, majd 6 percig 4 °C-on 3270×g-nál végzett centrifugálással szedtük le, és 1 ml pH 7,4-es PBS pufferben reszuszpendáltuk. Üregenként összesen 2 × 108 sejtet töltöttünk fel és 12%-os SDS-PAGE-on futtattunk, majd félszáraz blottolással nitrocellulózmembránra vittük át. A membránokat 2 órán át blokkoltuk szobahőmérsékleten 5% sovány tejjel (Roth) és Tris-pufferelt sóoldattal (TBS; pH 7,4), majd egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk a különböző CBP-k elleni egér poliklonális antitestekkel (1:500 5% sovány tejben + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Az enoláz elleni nyúl poliklonális antitestet (1:25 000 5% fölözött tejben + T-TBS) terhelő kontrollként használtuk. A membránokat T-TBS-szel mostuk, a CBP-ket a másodlagos fluoreszcensen jelölt IRDye® 800CW-vel detektáltuk. A kecske α-egér IgG-t és az enolázt fluoreszcensen jelölt IRDye® 680RD-vel detektáltuk. A kecske α-nyúl IgG ellenanyagot a megfelelő ellenanyaggal (1:15 000 5%-os sovány tejben, T-TBS-ben) 45 percig inkubáltuk sötétben, szobahőmérsékleten; a membránokat T-TBS-szel és végül egyszer TBS-szel mostuk. A membránok szkennelését Odyssey® CLx (LI-COR) szkennerrel végeztük.

Triton X-100 indukálta autolízis vizsgálat

Az S. pneumoniae D39 vad típusú, mutáns és komplementált törzset THY táptalajon tenyésztettük a log fázis közepéig, majd 6 percig 3275×g-en szedtük, és PBS-szel (pH 7,4) mostuk. Az 1 × 109 baktériumot tartalmazó 1 ml szuszpenziót 0,01%-os Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) végső koncentrációval inkubáltuk és 37 °C-on inkubáltuk. A baktériumsejtek lízisét 600 nm-en történő abszorbancia méréssel követtük nyomon előre meghatározott időpontokban.

Epithelial adherence assay

A hámsejtekhez való pneumococcus adherenciát humán A549 sejtekkel (ATCC® CCl-185TM) vizsgáltuk a leírtak szerint48. Röviden, az üveg fedőlemezeken (Hartenstein; 24 lyukú lemezekben, ~1 × 105 sejt/lyuk) növesztett konfluens epitélsejteket 5 × 106 közepes exponenciájú pneumococcussal oltottuk be, majd 37 °C-on és 5% CO2-on fertőzési tápfolyadékban (DMEM (HyClone™) + 1% hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérum (FBS)) inkubáltuk. Ezt követően a sejteket háromszor mostuk 1% FBS-t tartalmazó foszfáttal pufferelt sóoldattal (Gibco) a nem kötött baktériumok eltávolítása érdekében. Ezt követően a baktériumokat 1% para-formaldehidet (PFA, Roth) tartalmazó PBS-szel fixáltuk.

Immunofluoreszcens mikroszkópia

Az A549 sejtekhez kötött fixált pneumococcusokat háromszor mostuk PBS-szel, majd 1 órán át szobahőmérsékleten PBS + 10% FBS segítségével blokkoltuk. A mosást követően a mintákat 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk a pneumococcusok elleni poliklonális antitesttel (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) (nyúlban előállított, hővel inaktivált S. pneumoniae TIGR4 és D39 ellen). Másodlagos ellenanyagként fluoreszcenciával jelölt Alexa-Fluor488 kecske anti-nyúl ellenanyagot (Abcam) használtunk (1:500, 1 h, szobahőmérsékleten). A baktériumok tapadását osztályonként legalább 20 sejt esetében fedőlemezenként fluoreszcens mikroszkópiával követtük nyomon. Minden kísérletet háromszor két példányban megismételtünk. Minden adatot átlag ± s.d. A statisztikai elemzést párosítás nélküli, kétfarkú Student’s t-teszttel végeztük. Minden elemzés során a <0,05 p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Fagocitózis kísérletek

Antibiotikum-védelmi vizsgálat: A 24 lyukú lemezekben tenyésztett monocita THP-1 sejtek (ATCC® TIB-202TM) konfluens rétegét (3 × 105 sejt lyukanként RPMI-1640-ben (HyClone™), 10% hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal (FBS, Gibco) kiegészítve) 200 nmol ml-1 forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA, Sigma-Aldrich) hozzáadásával fagocitává differenciáltuk, majd 48 órán át 37 °C-on és 5% CO2-on inkubáltuk. Ezt követően a THP-1 sejteket 10% hő inaktivált FBS-szel kiegészített RPMI-1640-sel mostuk, és további 24 órán át 37 °C-on és 5% CO2-on inkubáltuk. A fertőzést megelőzően a pneumococcusokat THY-ban tenyésztettük a középső log-fázisig (A 600 = 0,35-0,45), centrifugáltuk, és fertőzési tápfolyadékkal (RPMI-1640, kiegészítve 1% hő inaktivált FBS-szel) mostuk. A THP-1 sejteket mostuk és 500 µl infekciós tápfolyadékban pneumococcusokkal fertőztük. A fertőzést centrifugálással (2 perc, 300×g) szinkronizáltuk, hogy a baktériumok és a fagociták egyidejűleg érintkezzenek egymással. Ezt követően a sejteket 37 °C-on és 5% CO2 -on inkubáltuk különböző időtartamokon keresztül. A fertőzést követően a sejteket fertőzési tápfolyadékkal mostuk, majd penicillin G-vel (100 egység ml-1, Sigma-Aldrich) és gentamicinnel (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) inkubáltuk 1 órán keresztül 37 °C-on és 5% CO2-on az extracelluláris baktériumok elpusztítása érdekében. Ezután a fagocitákat mostuk és 1%-os szaponinnal (Sigma-Aldrich) lizáltuk az intracelluláris pneumococcusok felszabadítása érdekében. Az intracelluláris baktériumok kolóniaképző egységeit (cfu) úgy határoztuk meg, hogy a baktériumokat megfelelő hígításban vér-agar lemezekre (Oxoid)49 ültettük. Az intracelluláris pneumococcusok időfüggő elpusztítását az extracelluláris pneumococcusok antibiotikumokkal történő elpusztításával értékelték a fent leírtak szerint. Ezt követően a fagocitákat különböző ideig (0-3 óra) fertőzési tápfolyadékban inkubáltuk tovább. Az intracelluláris bakteriális cfu-t a fent leírtak szerint követtük nyomon. Minden kísérletet négyszer ismételtünk meg duplikátumként. Az adatokat az antibiotikum-védelmi vizsgálatokban a fertőzés multiplicitására (MOI), illetve az időfüggő pusztításban a 0 órás időpontban visszanyert baktériumokra normalizáltuk. Minden vizsgálatot egyirányú ANOVA-val elemeztünk Bonferroni korrekcióval.

Kettős immunfluoreszcens festés és mikroszkópia

PMA-differenciált THP-1 sejteket (3 × 105 sejt/lyuk) steril üveg fedőlapokon (12 mm, Hartenstein) tenyésztettünk és pneumococcusokkal fertőztünk a fent leírtak szerint. A fertőzést követően a THP-1 sejteket fertőzési tápfolyadékkal mostuk, majd 4%-os para-formaldehiddel (Roth) fixáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. Az üveg fedőlemezeket PBS-szel mostuk és PBS + 10% hő inaktivált FBS-szel blokkoltuk 1 órán keresztül. Mosás után az extracelluláris baktériumokat poliklonális α-pneumococcus IgG-vel (1:500) és Alexa-Fluor488-mal jelölt másodlagos kecske α-nyúl IgG-vel (1:500, Abcam) festettük 30 percig szobahőmérsékleten. Az üveg fedőlapokat háromszor mostuk PBS-szel, miután a THP-1 sejteket 0,1%-os Triton X-100-mal PBS-ben permeabilizáltuk (10 perc, szobahőmérsékleten). A mosást követően az intracelluláris pneumococcusokat poliklonális α-pneumococcus IgG-vel (1:500) és másodlagos Alexa-Fluor568-mal jelölt kecske α-nyúl IgG-vel (1:500, Abcam) festettük 30 percig szobahőmérsékleten. A kísérleteket duplikátumként háromszor ismételtük meg. A statisztikai elemzéshez üveg fedőlemezenként 50 sejtet elemeztünk az intracelluláris baktériumok száma szempontjából. Az adatokat a MOI-ra normalizáltuk. Minden vizsgálatot egyirányú ANOVA-val elemeztünk Bonferroni korrekcióval. Minden elemzés során a <0,05 p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Cellavonalak

Az ebben a vizsgálatban használt sejtvonalakat az ATCC-től vásároltuk (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202), és PCR és pásztázó elektronmikroszkópia segítségével megvizsgáltuk, hogy mycoplasma-negatívak.

Akut egér tüdőgyulladás és szisztémás fertőzés modell

A nyolc-tizenkét hetes nőstény CD-1 egereket (tenyésztett, Charles River, Sulzfeld, Németország) intranazálisan fertőztük biolumineszcens pneumococcusokkal a közelmúltban leírtak szerint50. Röviden, a pneumococcusokat a középső exponenciális fázisig (A 600 = 0,35) tenyésztették THY táptalajban, amely 10% hővel inaktivált magzati szarvasmarha-szérumot tartalmazott. Centrifugálás után a fertőzési dózist (20 µl) ~2,5 × 107 cfu-ra állítottuk be PBS-ben (pH 7,4). Az orrfertőzéshez az egereket ketamin/xilazin (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Németország; Rompun, Provet AG, Lyssach, Németország) intraperitoneális injekciójával altattuk, és a baktériumokat cseppenként az orrlyukakba juttattuk. A fertőzési dózis cfu mennyiségét az inokulum sorozatos hígításainak vér-agar lemezekre történő ültetésével igazoltuk. Az egereket az IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA) segítségével előre kiválasztott időközönként nyomon követtük a túlélést és a biolumineszcenciát. A szisztémás fertőzési modellhez 3 × 103 cfu fertőzési dózist adtunk be intraperitoneálisan 200 µl PBS-ben (pH 7,4). Minden állatkísérletet a Laborállat-tudományi Társaság németországi szabályzata (GV-SOLAS) és a Laborállat-tudományi Egyesületek Szövetségének (FELASA) európai egészségügyi törvénye szerint végeztünk. Minden kísérletet a Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Németország, engedélyszám: 7221.3-1-056/16-1) hagyott jóvá.

Adatok elérhetősége

A S. pneumoniae genomikai szekvenciaadatait tartalmazó nyers FASTQ-fájlokat az EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) számára nyújtották be, és a Short Read Archive (SRA) adatbázisban tárolták a RJEB18558 tanulmányozási szám alatt. A vizsgálat eredményeit alátámasztó minden egyéb releváns adat elérhető ebben a cikkben és a kiegészítő információs fájlokban, illetve kérésre a megfelelő szerzőktől.