2.2 A levan előállítási stratégiái

A levan exopoliszacharidként (EPS) szintetizálódik különböző nemzetségekhez tartozó baktériumok, például Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus és Zymomonas extracelluláris mátrixában (Sarilmiser et al., 2015). Ezeken az extremofil levantermelőkön kívül Poli és munkatársai (2009) a Halomonas sp. levantermelőről számoltak be. További tanulmányok a Halomonas levan lehetséges felhasználását vizsgálták bioflokkuláló szerként (Sam et al., 2011), peptid- és fehérjealapú gyógyszerhordozó rendszerként (Sezer et al., 2011, 2015), biokompatibilis vékony (Sima et al., 2011, 2014), ragasztó többrétegű filmként (Costa et al., 2013) és heparint utánzó glikánként (Erginer et al., 2016). A 12.2. ábra a mikrobiális levan előállításának általános folyamatát mutatja be.

12.2. ábra. A levan alapvető feldolgozási lépései.

A mikrobiális EPS-eket általában aerob, merülő fermentációs rendszerekben állítják elő. Az erjesztési körülmények, például a levegőztetés, a keverés, a pH, az oldott oxigén koncentrációja, a hőmérséklet, a közeg összetétele és a bioreaktor kialakítása meghatározhatják a termék jellemzőit és a termelési hozamot. Ezért a magas termelési minőség és hozam elérése érdekében ezen paraméterek részletes optimalizálását kell elvégezni az egyes organizmusok esetében (Öner et al., 2016). Srikanth és munkatársai (2015) például Acetobacter xylinum NCIM2526 termelő törzset használva vizsgálták a fermentációs paraméterek, köztük a kiindulási pH, a levan-kiegészítés, a szacharóz koncentráció, a nitrogénforrás, az inokulum koncentráció és a tenyésztési idő hatását a levan-szintézisre. Az optimális feltételeket 10, 50-60 és 1,49 g/l nitrogén, szacharóz és inokulum tekintetében határoztuk meg. A levanhozam az első 24 óra után jelentősen nőtt, és a maximális levantermékenységet 122 óra elteltével érték el, amikor a kiindulási pH-t 6,8-ra állították be. A kezdeti levan-kiegészítés 0,1 g/l-ről 0,4 g/l-re történő növelése 1,22 g/l-ről 1,65 g/l-re növelte a levanhozamot; a 0,4 g/l feletti értékek nem növelték tovább a hozamot. Az 5% (v/v) és 10% (v/v) közötti oltóanyag-koncentráció a vártnak megfelelően változást eredményezett a levanhozamban, és a maximális hozamot (1,46 g/l) 7% (v/v) mellett érték el. A 20 és 80 g/l közötti szacharózkoncentráció befolyásolta a levanhozamot. A 40-50 g/L tartományban a termelés hozama nőtt, a 70-80 g/L tartományban csökkent, a 20-40 g/L tartományban pedig nem változott.

Sarilmiser és munkatársai (2015) egy halofil mikroorganizmus (Halomonas smyrnensis AAD6T) levantermelését vizsgálták különböző stimuláló tényezők alkalmazásával. Például különböző etetési stratégiákat alkalmaztak különböző időközönként egy szakaszos bioreaktoros rendszerben, és többféle kezdeti feltételt teszteltek rázókultúrákban. A tesztelt különböző pH-értékek és szacharóz-koncentrációk közül a maximális levanhozamot pH 7 (1,345 g/l levan) és 50 g/l szacharóz (1,320 g/l levan) mellett érték el. Nitrogén- és foszforkorlátozás esetén mind a levan-koncentráció, mind a biomassza csökkent, míg az Yp/x értékek növekedtek. A nitrogénimpulzus-stratégiák csökkentették a levanszintézist a meghosszabbított növekedési időszak miatt, a szacharózimpulzus-stratégiák jelentősen javították a sejtnövekedést és a levantermelést, a NaCl-impulzusnak pedig nem volt hatása a növekedésre. Érdekes módon a bórsav jelenlétében növesztett kultúrák termelték a legmagasabb levan-koncentrációt (8,84 g/l) ellenőrzött bioreaktoros körülmények között. Ezt a javulást a quorum sensing (QS) néven ismert biológiai jelenséggel magyarázták, amelyben bóratomok vesznek részt; a H. smyrnensis AAD6T-ben a QS-ben részt vevő egyik jelzőmolekulát később egy C16-acil-homoszerinelaktonként azonosították (Abbamondi et al., 2016).

A levan molekulatömege döntő tényező a különböző iparágakban, köztük az élelmiszer-, kozmetikai és orvosi iparban való alkalmazhatóságában (Belghith et al., 1996). A levan előállításához optimalizált feltételek meghatározása létfontosságú a kívánt molekulatömegű vegyület előállításához (Porras-Domínguez et al., 2015). Wu és munkatársai (2013) például a gyártási folyamat finom módosításait értékelték a levan különböző molekulatömegű anyagainak megszerzése érdekében szakaszos és etetett szakaszos rendszerekben, Bacillus subtilis (natto) Takahashi-törzset használva termelő törzsként. Amikor magas (400 g/l) és alacsony (20 g/l) szacharóz-koncentrációt alkalmaztak, a levan alacsonyabb, illetve magasabb molekulatömegét kapták. Ezt a lineáris összefüggést a szacharóznak a levansukráz enzimre gyakorolt hatásának tulajdonították. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a levan molekulatömege a reakció körülményeitől függött, mint például a pH, a hőmérséklet, a keverési sebesség és a szacharóz, és az utóbbi volt a levan molekulatömegét leginkább meghatározó tényező.

A levan immobilizált sejtes rendszerekben történő előállítása azért is előnyös, mert az ilyen rendszerek előnye a viszonylag egyszerű downstream folyamatok, a nagy volumetrikus termelékenység, a fejlett folyamatirányítás és a csökkentett szennyeződési kockázat az EPS előállításában (Ürküt et al., 2007). Ennek a kedvező módszernek a megvalósítása a levan termelésben a szakaszos, az etetett szakaszos és a folyamatos folyamatok alternatívájaként használható (Öner és mtsai., 2016). Silbir és munkatársai (2014) például a levan termelést vizsgálták szakaszos és folyamatos fermentációs rendszerekben Zymomonas mobilis B-14023 segítségével. A folyamatos fermentációs produkciókat Ca-alginát immobilizált sejteket alkalmazó, csomagolt ágyas bioreaktorban futtatták. Az inkubációs idő, a kiindulási pH és a szubsztrátkoncentráció volt a három legjelentősebb folyamatváltozó a levan szakaszos rendszerben történő előállítása során. A legnagyobb mennyiségű levan (40,2 g/l) akkor keletkezett, amikor élesztőkivonatot használtak szerves nitrogénforrásként a rázólombikos kultúrákban. Ezenkívül a folyamatos fermentációs rendszerben immobilizált Z. mobilis sejteket sikeresen alkalmazták levan előállítására. A rendszernyomás kontrollálhatatlan csökkenése és a Ca-alginát gélgyöngyök felbomlása jelentette a hosszabb fermentációs idők legfőbb korlátját.

A levan-termelő mikroorganizmusok sokfélesége ellenére a levan poliszacharid előállítási költségei továbbra is magasak. Valószínűleg ez a legnagyobb szűk keresztmetszet a kereskedelmi forgalomba hozatalában (Öner és mtsai., 2016; Sarilmiser és mtsai., 2015). A fermentációs közeg a mikrobiális folyamat előállítási költségeinek körülbelül 50%-át teszi ki (Van Hoek és mtsai., 2003); azonban korábban olcsó szénforrásokat, például szirupokat és melaszt használtak mikrobiális levan előállításához (Özcan és Öner, 2015). Kucukasik és munkatársai (2011) cukorrépa-melaszt és keményítő-melasztot vizsgáltak szacharózhelyettesítőként Halomonas-kultúrákban. Tisztítást, pH-t, kénsavat, trikalcium-foszfátot és aktív szenet tartalmazó előkezelést alkalmaztak különböző kombinációkban a levantermeléshez szükséges kémiai rendelkezésre állás beállítására. Arra a következtetésre jutottak, hogy a maximális levanhozam 10 g/l TCPHAC-koncentráció mellett 4,19 és 3,68 g/l volt. A 30 g/l TCPHAC és HAC alkalmazásakor 7,56 és 4,44 g/l levanhozamot értek el. A nehézfémek eltávolítása és a vaskoncentráció növelése a sejtek integritásának és a levanhozamnak a csökkenését eredményezte ebben a vizsgálatban. Más vizsgálatokban a Bacillus lentus V8 tenyészetekben fekete csíkos cukornádmelaszt (Abou-Taleb et al., 2015), Mycobacterium levaniformis 1406 tenyészetekben datolyaszirupot (Moosavi-Nasab et al., 2010), cukorrépa-melasz Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 kultúrákban (Han és Watson, 1992), valamint cukornád-melasz és -szirup Z. mobilis ATCC 31821 kultúrákban (De Oliveira et al., 2007) vizsgálták, mint olcsó szénforrásokat a levan termeléséhez.

A levan bioszintézisét merülő fermentációs rendszerekben korlátozza a sejtnövekedés követelménye, amely nem feltétlenül felel meg a magas levanszukráz aktivitás optimális feltételeinek (Santos-Moriano et al., 2015). A sejtmentes rendszerek azonban megszüntetik ezt a korlátozást, és további előnyökkel járnak, mint például a könnyű előkészítés, az újrafelhasználhatóság és a mikrokörnyezeti változások ellenőrzése (Jang és mtsai., 2001). Emiatt kulcsfontosságú a levansukráz számára optimális környezet biztosítása. Lu és munkatársai (2014) például különböző tényezők, például a szubsztrátkoncentráció, a reakcióidő, a hőmérséklet és a pH hatását vizsgálták a levan termelésére rekombináns levansukráz felhasználásával sejtmentes rendszerben. Megfigyelték a levan maximális hozamát (7,1 g/L) 0,8 M szacharóz, pH 6,5 és 40 °C 24 órás alkalmazásával. A levan hozama párhuzamosan nőtt a szacharóz koncentrációjának 0-ról 0,8 M-ra történő növelésével. Vizsgálatuk azt mutatta, hogy a rekombináns enzim a natív enzimhez hasonló biokémiai tulajdonságokkal rendelkezik.