Biological Assays of Bradykinin and Related Kinins
A kininek minden vizsgált állatfajban erős vérnyomáscsökkentők (54). E peptidek legelterjedtebb in vivo tesztje a korábban leírt patkányvérnyomásvizsgálat. A kininek értágító hatását izolált, intakt endothellel perfundált szervekben mérik a IV. szakaszban leírt eljárás szerint. A kininek artériás erekben kifejtett relaxáló hatását in vitro a kutya nyaki verőérben (57) a Regoli és Barabé (34) által leírt módszerrel értékelik. A vénakonstriktor hatást in vitro mérik nyúl nyaki vénában (42), az alább összefoglalt eljárás szerint.
A nyulakból (1,0-2,0 kg) vett vénákat 2 mm széles és 2 cm hosszú helikoidális csíkokra vágják, és Krebs-oldatban (37 °C-on oxigénnel telített) felfüggesztik, amely a kinin lebomlásának megakadályozására konvertáló enzimgátlót (kaptopril, 10 μM) tartalmaz (34). A kininekre adott szöveti összehúzódásokat a korábban leírt módon rögzítjük, és általában teljes koncentráció-válasz görbéket mérünk a kininek és antagonistáik affinitásának értékeléséhez. Kimutatták, hogy a nyúl nyaki vénája tartalmaz egy B2-receptor altípust (B2A) (V. táblázat).
A leggyakrabban használt nem vaszkuláris preparátum a tengerimalac ileum, amelyet 250-350 g-os tengerimalacokból vesznek és Rang (37) szerint hosszanti simaizom szalagként preparálnak. A szövetet in vitro Krebs-oldatban (37 °C-on oxigénnel telített) szuszpendáljuk, és feszültségváltozásait a fentiekben az izolált ereknél leírt módon mérjük (lásd az I. szakaszt). A tengerimalac ileum a B2B receptor altípus jellemzésére használt preparátum (V. táblázat).
A B1 receptorokat nyúl aortacsíkkal vizsgálják, amelyet az angiotenzinhez hasonló módon készítenek és kezelnek. A szövet a kísérlet elején szinte érzéketlen a kininekre, különösen a desArg9BK-ra, a Bt receptor agonistájára. A szövet érzékenysége az inkubáció több órája (akár 6-10 óra) alatt növekszik, mivel a B1-receptorok de novo képződnek (55). A kininek kontraktilis hatását az I. szakaszban az angiotenzin esetében leírt műszerekkel és megközelítésekkel rögzítjük és elemezzük. A nyúlszövetek érzékenyíthetők a desArg9BK-ra az állatok lipopoliszachariddal (LPS) történő előkezelésével, amelyet az állat megölése előtt 5 órával intravénásan adnak be (56). Az LPS által történő B1-receptor-generálás mechanizmusát vizsgálták (60, 61). Az LPS-szel kezelt nyulakból vett aorták és más szövetek már az in vitro inkubáció kezdetétől reagálnak a desArg9BK-ra (56). Hasonlóképpen a kutyák veseartériái spontán B1-receptorokat expresszálnak, és nagy érzékenységet mutatnak a desArg9BK-ra (62).
A kininreceptorok jellemzésére izolált szervekben több vegyületet is használtak, három preparátum biológiai (kontraktilis) válaszát felhasználva (V. táblázat). A bradikininek és a kallidin erős stimulánsok a nyúl nyaki vénában (RJV) és a tengerimalac ileumban (GPI), míg a desArg9BK és a Lys,desArg9BK inaktívak. A nyúl aortájában (RA) a hatásosság ellentétes sorrendje figyelhető meg. desArg9BK csak az RA-n antagonista. Ezek alapján Regoli és Barabé (54) javasolta a két kininreceptor hipotézist, a B1 (RA) és a B2 (RJV, GPI és sok más készítmény és vizsgálat), amelyet kezdetben csak agonistákkal jellemeztek (54), majd később (lásd alább) antagonistákkal is jellemeztek. A B2 receptor antagonistáit Vavrek és Stewart (63) azonosította, majd különböző kutatók (64-66) a Pro3 hidroxiprolinnal (Hyp) való helyettesítésével, d-Arg hozzáadásával az N terminushoz, a Phe8 Leu-val való helyettesítésével és a Pro7-Phe8 dipeptid d-Tic-Oic-kal való helyettesítésével javították (67-69). Az V. táblázatban az egyes antagonista-sorozatok prototípusát közöljük, hogy az 5. és 9. pozícióban nincs szükség b-2-tienil-elaninra (Thi), míg a Hyp3 és a d-Arg0 fontosak az affinitás szempontjából, különösen az RJV-nél. A Phe8 Leu-val való helyettesítése a többi módosításhoz hozzáadva d-ArgBK-t eredményez, amely a) szinte teljesen nélkülözi az agonista aktivitást, és b) aktív az RJV-n, kevésbé aktív a GPI-n, és meglehetősen gyenge az RA-n (B1), és ezért meglehetősen szelektív a B2-helyen. Az RJV és a GPI közötti pA2 értékek közötti (két logegységnyi) különbség meghatározó megállapítás a B2-receptorok javasolt (V. táblázat) B2A (RJV) és B2B (GPI) felosztásához. A D-ArgBK kompetitív antagonista, in vivo és in vitro is gyorsan reverzibilis, és különbözik a Hoe 140-től, amely nem kompetitív (nem egyensúlyi), valószínűleg azért, mert mind a B2A, mind a B2B helyekkel hosszan tartó kölcsönhatása van (59, 67, 68, 70). A B2A és B2B közötti megkülönböztetést alátámasztják a két utolsó vegyülettel kapott eredmények (V. táblázat), amelyek a harmadik pozícióban lévő maradék által különböznek. A Hyp jelenléte kedvez az antagonizmusnak (pA2 7,6) a B2A-n és részleges agonista aktivitásnak a B2B-n, míg a Tyr3 erős agonistát ad a B2A-n és meglehetősen jó antagonistát (tiszta antagonista) a B2B-en. Ezt az új osztályozást egy áttekintő cikkben mutatták be (71). A kinin funkcionális helyei tehát a B, és a B2 (két altípusra gondolunk). Több más receptort (B3, B4 és B5) is javasoltak (72-74), de létezésüket nem sikerült szilárd kísérleti adatokkal bizonyítani (lásd a kritikai áttekintést a hivatkozott 59. hivatkozásban). A kinin által kiváltott hisztamin felszabadulás patkány peritoneális masztocitákból nem specifikus jelenség, amelyet a kininek kationos jellegének tulajdonítanak (75, 76).