Introduction

A csigolyák jelenléte a gerincesek testfelépítésének egyik meghatározó jellemzője. A csigolyacsontváz állhat a gerincvelőt fedő páros idegi ívek sorozatából, a farokartériát és a farokvénát körülvevő páros vénaívekből, és sok állkapocsgerincesben (gnathostomákban) a notochordot mint uralkodó tartószerkezetet helyettesítő centrumok sorozatából. A gerinccentrák morfológia és szöveti összetétel szempontjából igen változatosak, és valószínűleg egymástól függetlenül fejlődtek ki számos különböző gnathosztóm vonalban, beleértve a négylábúakat, a teleosztrikus halakat és a porcos halakat . Ez a nyilvánvaló evolúciós konvergencia kérdéseket vet fel a csigolya vázelemek embrionális eredetével kapcsolatban a gnathostomákban.

A tetrapodákban a csigolya váz minden összetevője a szomitákból származik: a szegmentált paraxiális mezodermának átmeneti, kétoldali blokkjai, amelyek az embrionális törzsben dorsalisan alakulnak ki. A szomiták dorzális és ventrális alosztályokra oszlanak, amelyekből a törzs kötőszövete és izomzata (“dermomyotom”), illetve csontvázszövetei (“szklerotom”) keletkeznek. A sejtvonal-követési kísérletek, amelyek során csirke- fürj kímerákat és fluoreszcein-dextrán injekciókat vagy GFP-transzgén donorembriókból származó transzplantátumokat használtak axolotlban, kimutatták, hogy a csigolyacsontváz teljesen szomális eredetű ezekben a taxonokban, a szomális eredetű sejtek a fejlődő ívekben és a centrumok kialakulóban lévő porcaiban találhatók meg.

Ezzel ellentétben a teleoszt rájauszonyos halakban a csigolyacsontváz kettős embrionális eredetűnek tűnik, mind a paraxiális mezodermából, mind a notochordból származó hozzájárulásokkal. A teleoszt csigolyacentrumok egy belső rétegből (chordacentrum) és egy külső rétegből állnak, mindkettő csontból áll, amely intramembrán csontosodással alakul ki. A teleosztok chordacentruma alakul ki először a csontmátrix fehérjék (pl. SPARC, I. típusú kollagén) kiválasztásával a notochord epitheliumában található “chordoblast” sejtekből . A zebrahalakban in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a tenyésztett notochord sejtek képesek csontmátrixot kiválasztani, és ablációs kísérletek kimutatták, hogy notochord hiányában a chordacentra nem alakul ki . A teleoszt chordacentrákat később egy viszonylag későn fejlődő, paraxiális mezodermából származó membráncsont réteg veszi körül . Továbbá, a szomita mintázódási hibákkal rendelkező zebrahal mutánsok normálisan fejlődő chordacentrával rendelkeznek, de mély neurális és haemalis ívdefektusokat mutatnak, ami az ívszövetek valószínű paraxiális mezodermális eredetére utal .

Annak meghatározásához, hogy a csigolyaközök kettős eredete a csigolyacsontváz teleoszta-specifikus jellemzője, vagy a gnathosztómák általános jellemzője, amely a tetrapodákban elveszett, a csigolyák embrionális eredetére vonatkozó adatokra van szükség a csontos halak (azaz az Osteichthyes: a tetrapodákat és a teleosztákat magában foglaló csoport) egyik külső csoportjából. A porcos halak (Chondrichthyes: cápák, ráják, ráják és holocephalák) kulcsfontosságú filogenetikai pozíciót foglalnak el a csontos halak testvércsoportjaként, és ezért az ebből a vonalból származó adatok segíthetnek a gnathostomák utolsó közös ősének primitív fejlődési feltételeire való következtetésben. Korábban kimutattuk, hogy a kis rája (Leucoraja erinacea) csigolyái egy-egy háti ideggerincből, a gerincvelőt körülvevő kétféle háti porcból (ideg- és interkaláris ívek), egy-egy ventralisan nyúló velős ívből és gerincből, valamint egy háromrétegű centrumból állnak (1. ábra) . Itt szomita és notochord sorstérképezési kísérleteket, valamint a vázmátrix fehérjéket kódoló gének mRNS in situ hibridizációját használjuk a rája csigolyacsontváz embrionális eredetének vizsgálatára. Megmutatjuk, hogy a ráják csigolyacsontvázának minden összetevője a paraxiális mezodermából származik, és nincs bizonyíték a notochord sejtes vagy mátrix hozzájárulására. A csontos halakból származó adatokkal együtt vizsgálva eredményeink a gerincoszlop általános és valószínűleg primitív paraxiális mezodermális eredetére utalnak az állkapcsos gerinceseknél.

Anyag és módszerek

(a) A szomiták sorsának feltérképezése

Leucoraja erinacea embriókat a Woods Hole-i (MA) Tengerbiológiai Laboratóriumból (MBL) szereztük be, és S24-ig körülbelül 16°C-on, átfolyós tengeri asztalban tartottuk. Az ikraházon borotvapengével egy lapocskát vágtunk, és az embriót és a sárgáját Petri-csészébe helyeztük át. Az embriókat MS-222 (100 mg l-1 etil-3-aminobenzoát-metánszulfonát-Sigma-Aldrich) tengervizes oldatában érzéstelenítettük. A CellTracker CM-DiI-t (Thermofisher) (5 µg µl-1 etanolban) 1 : 10 arányban hígítottuk 0,3 M szacharózban, és egy húzott üvegkapilláris tű és egy Picospritzer nyomásinjektor segítségével a szomiták ventrális részeibe injektáltuk (embriónként egy-három injekció) (2a. ábra). Az embriókat ezután visszahelyezték az ikrahüvelyükbe, és visszatették őket a tengeri asztalra, hogy körülbelül 7-12 hétig fejlődjenek. Az embriókat ezután 4%-os PFA-val rögzítették a Criswell et al. .

(b) Notochord sorsának feltérképezése

Az embriókat a fent leírt módon tartottuk S14-ig, amikor is az embrió fölött egy kis ablakot vágtunk a peteházba. CM-DiI-t mikroinjekcióztunk a notokhord-háromszögbe a fent leírtak szerint (2b. ábra). Az ablakot ezután donor tojáshéjjal és Krazy Glue™ géllel lezártuk (2c. ábra), majd az ikrákat visszahelyeztük a tengeri asztalra, hogy további 16-18 hétig fejlődjenek a rögzítés előtt (a Criswell et al. leírása szerint).

(c) A CM-DiI-injekció elhelyezésének validálása

A CM-DiI-injekciók helyes elhelyezésének ellenőrzésére három szomita-injektált embriót közvetlenül az injekciózás után, három notochord-injektált embriót pedig 5 nappal az injekciózás után (dpi) fixáltunk. Az embriókat 4%-os paraformaldehidben PBS-ben fixáltuk egy éjszakán át 4°C-on, majd 3 × 15 percig öblítettük PBS-ben, és 1 µg ml-1 DAPI-val festettük egy éjszakán át szobahőmérsékleten. A szomittal injektált embriókat Zeiss lightsheet mikroszkópon, a notochorddal injektált embriókat pedig Zeiss lightsheet vagy LSM 780 konfokális mikroszkópon képeztük le.

(d) Hisztológia és mRNS in situ hibridizáció

A CM-DiI-vel jelölt L. erinacea embriókat paraffinba ágyaztuk és 8 µm vastagságban metszettük az O’Neill et al. leírása szerint a szövettani elemzéshez. A beágyazás előtt az embriókat 14 napig 10%-os EDTA-ban (etiléndiamintetraecetsav) demineralizáltuk. A hisztokémiai festést Witten és Hall Masson trikróm protokollja szerint végeztük. A Col1a1 (GenBank hozzáférési szám MG017616) és SPARC (GenBank hozzáférési szám MG017615) in situ hibridizációs kísérleteket az O’Neill et al. által leírtak szerint végeztük a metszeteken, a Gillis et al. szerinti módosításokkal.

Eredmények

(a) Somitikus hozzájárulás a ráják csigolyavázának minden komponenséhez

A ráják csigolyavázához való somitikus hozzájárulás vizsgálatához CM-DiI-t mikroinjektáltunk a ráják embrióinak ventrális részeibe (azaz a feltételezett szklerotómába – 3a. ábra) az (S) 24. stádiumban (Ballard et al. ). A szomiták fokális jelölését (notokordális szennyeződés nélkül) fénylemez-mikroszkópiával igazoltuk a közvetlenül az injekció beadása után rögzített embriókban (3b. ábra; n = 3). 50-52 dpi-re (S31) a centrum fejlődő areoláris szövetének orsó alakú sejtjei körülveszik a notochordot, és a preszkeletális mesenchima a neurális cső és a caudalis artéria és véna köré tömörült. Az ebben a stádiumban elemzett összes embrióban (n = 5) CM-DiI-t találtunk a fejlődő areoláris szövet orsó alakú sejtjeiben (3c. ábra), ami jelzi ezek somitikus eredetét.

109 dpi-re (S34) a csigolyák teljesen kifejlődtek, ideg-, interkaláris és vérboltozattal, valamint háromrétegű centrummal (1. ábra). Az ebben a stádiumban elemzett embriókban (n = 4) CM-DiI-pozitív sejteket találtunk az egész csigolyacsontvázban. CM-DiI-pozitív sejteket találtunk a neurális (n = 3 csigolya három embrióban) és a vérboltozat porcában (n = 6 csigolya négy embrióban; 3d,e ábra), valamint a porc belső rétegében (3f. ábra; n = 2 csigolya két embrióban), a középső areoláris szövetben (3g. ábra; n = 3 csigolya három embrióban) és a centrum külső porcában (3h. ábra; n = 3 csigolya három embrióban). Ezek az eredmények együttesen azt bizonyítják, hogy a ráják csigolyacsontvázának minden fő komponenséhez hozzájárul a szklerotikus sziklák hozzájárulása.

(b) Nincs bizonyíték a notokord hozzájárulására a csigolyacsontvázhoz a rájáknál

A notokordnak a ráják csigolyacsontvázához való sejtes hozzájárulásának vizsgálatához egy sor notokord-sors-térképezési kísérletet végeztünk. A porcos halakban a notochord egy kis háromszög alakú, progenitor sejtekből álló régióból (“notochord-háromszög”) származik, amely a blastodiscus hátsó peremén jelenik meg S12-nél. A rájaembriók notochord-háromszögét S14-ben CM-DiI-vel fokálisan megjelöltük (4a. ábra), és a festék notochordra való lokalizációját 5 dpi-nél (kb. S17) konfokális mikroszkópiával igazoltuk. Három S17-ben vizsgált embrióban a CM-DiI-t vagy csak a notokordban (n = 2), vagy a notokordban és az idegszövetben (n = 1) találtuk (4b. ábra). Egyetlen esetben sem mutattak ki CM-DiI-jelölt sejteket a paraxiális mezodermában.

Ezért több rájaembrió notochord-háromszögét S14-nél megjelöltük, és ezeket az embriókat 116-129 dpi-ig (S34 – amikor a csigolyacsontváz már teljesen differenciálódott) neveltük. A CM-DiI-t a tengelyoszlop csigolyák közötti régióinak notochordjában (4c,c′ ábra) és notochord epitéliumában (4d,d′ ábra) mutatták ki (n = 5). Három embrióban CM-DiI-pozitív sejteket találtunk a notochord epitélium maradványaiban, amelyek a centrum közepén fennmaradtak, ahol a notochordot szinte teljesen helyettesíti a centrum belső porcrétege, de magában a porc belső rétegében nem találtunk CM-DiI-pozitív kondrocitákat. A tengelyoszlop más komponenseiben nem figyeltek meg CM-DiI-jelölt kondrocitákat. Ezek a kísérletek tehát nem szolgáltatnak bizonyítékot a notochord sejtes hozzájárulására a csigolyacsontvázhoz.

A teleosztokban a notochord epitheliumában lévő chordoblast sejtek szekretálják a mátrixkomponenseket, amelyek a chordacentrum acelluláris csontját alkotják. Bár a ráják nem rendelkeznek chordacentrummal, a ráják centrumának areoláris szövete mineralizálódik, és eredeténél fogva a notochord epithelium mellett helyezkedik el . Annak vizsgálatára, hogy a notochord epitélsejtek hozzájárulnak-e a mátrixkomponensekhez a rája centrumszövetében, jellemeztük a Col1a1 és SPARC csontmátrixfehérjéket kódoló gének expresszióját a fejlődő rája centrumban. Nem mutattuk ki a Col1a1 (5a. ábra) vagy a SPARC (5b. ábra) transzkripcióját a notochord epitheliumban. Ezek a transzkriptek inkább az areoláris szövet orsó alakú sejtjeiben lokalizálódtak (5a,b ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy magának az areoláris szövetnek a paraxiális mezodermából származó sejtjei – és nem a notochord epitéliuma – a forrása a rája csigolya centrumának mineralizált szövetének extracelluláris mátrixának.

Diszkusszió

A szomita sorsát feltérképező kísérleteink azt mutatják, hogy a vélelmezett szklerotóma hozzájárul a ráják csigolyáinak minden összetevőjéhez, beleértve az ideg- és vérboltozatot, valamint a háromrétegű csigolyaközpont minden szövetét. Bár lehetséges, hogy a DiI az injekció beadása után diffundálhat az extracelluláris mátrixon keresztül, és szennyezheti a tervezett célpont (pl. notochord) melletti szöveteket, ezt a lehetőséget az embriók egy alcsoportjának röviddel az injekció beadása utáni képalkotásával kontrolláltuk, hogy validáljuk a jelölés pontosságát, és kiegészítő notochord-sors-térképezési kísérleteket végeztünk. Ez utóbbiban azt találtuk, hogy a notochord progenitor sejtek CM-DiI jelölése kizárólag a notochord és a notochord epithelium jelölését eredményezte, a csigolyaszövetek nem járultak hozzá. A teleost halakban a notochord epitheliumon belüli chordoblast sejtek expresszálják az I-es típusú kollagén és SPARC csontmátrix fehérjéket kódoló géneket, és valószínűleg a csontmátrix forrása a csigolya centrum legkorábbi rétege számára. Mivel a ráják csigolyaközépcsontjukon belül is van mineralizált réteg, mRNS in situ hibridizációval próbáltuk megvizsgálni a Col1a1 és a SPARC expresszióját a ráják csigolyafejlődése során. Úgy találtuk, hogy ezek a gének kizárólag az areoláris szövet (a centrum mineralizált középső rétegének előfutára – Chriswell és mtsai. ) eredendően orsó alakú sejtjeiben fejeződnek ki, és nem a notochord epitéliumában. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a rája csigolya centrumának sejtjei és mátrixkomponensei teljes egészében paraxiális mezodermális eredetűek.

A csontos halakból származó adatokkal együtt vizsgálva, a rája csigolya csontvázának somitikus eredetére vonatkozó kimutatásunk arra utal, hogy ez a szövet valószínűleg a csigolya vázszöveteinek egyetlen, primitív forrása volt a gnathostomákban, és a notochord hozzájárulása a centrum csontozatához a teleoszthalak származékos állapotát jelenti (6. ábra). A korai fosszilis állkapcsos és állkapocs nélküli halakból származó bizonyítékok erősen arra utalnak, hogy a gnathostomák utolsó közös ősének csigolyacsontváza egyszerűen egy sor idegboltozatból és egy tartós notochordból állt, centra nélkül. Több gnathosztóm vonal, köztük az elasmobranch porcos halak, a teleosztómák és a tetrapodák, később egymástól függetlenül centrákat fejlesztettek ki . Eredetükben az elasmobranchák és a tetrapodák csigolya centrája teljes egészében a paraxiális mezodermából származott , de a teleost centrák független eredetével a notochordból származó acelluláris csont belső rétege beépült a centrumba.

Még nem világos azonban, hogy a teleosztok e specializált állapota egyedülálló-e a rájauszonyú halak között. A filogenetikai minták közelmúltbeli változásai ellenére , a gerinccentrák nagy valószínűséggel egymástól függetlenül fejlődtek ki több, nem teleosztos rájaszárnyú hal vonalban (pl. a gari és a bichir ). Nem világos azonban, hogy a notochord hozzájárul-e a centrák e taxonokban megfigyelt különböző formáihoz. Átfogó elemzésekre van szükség a csigolyaszövetek embrionális eredetéről stratégiailag kiválasztott haltaxonokban, hogy jobban meg lehessen oldani a tengelycsontvázak sokféleségének – vitathatatlanul a gerincesek legfontosabb jellemzőjének – evolúciós és fejlődési összeállítását általában.

Etika

Minden kísérleti munka az MBL Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága által jóváhagyott protokolloknak megfelelően történt.

Adatok hozzáférhetősége

A jelen tanulmányban szereplő génekhez kapcsolódó szekvenciaadatok a GenBankban elérhetők (Col1a1 accession number MG017616 és SPARC accession number MG017615).

A szerzők hozzájárulása

K.E.C. elképzelte a vizsgálatot, elvégezte a szövettani, sors-térképezési és in situ hibridizációs kísérleteket, és megszerkesztette a kéziratot; M.I.C. koordinálta a vizsgálatot és hozzájárult a kézirathoz; J.A.G. megtervezte a vizsgálat egyes részeit, koordinálta a vizsgálatot és segített a kézirat megírásában. Minden szerző véglegesen jóváhagyta a publikálást.

Kompetitív érdekek

A szerzők nem jelentenek be konkurens érdekeket.

Finanszírozás

A tanulmányt a National Science Foundation DDIG (DEB 1501749), a University of Chicago/Marine Biological Laboratory Graduate Student Research Award, a Company of Biologists Travelling Fellowship és a Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) támogatta K.E.C. számára.; a Royal Society egyetemi kutatási ösztöndíja (UF130182), az Isaac Newton Trust ösztöndíja (14.23z) és a Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling és Laura és Arthur Colwin kutatási ösztöndíja J.A.G. számára.; valamint a National Science Foundation ösztöndíja (DEB 1541491) és a Chicagói Egyetem kutatási támogatása M.I.C.

Footnotes