Animals

A vizsgálat idején minden egér 3-11 hónapos C57BL/6 hím volt. Az egereket a Jackson Laboratories-tól vásárolták, hőmérséklet- (22 °C) és fényszabályozott létesítményben tartották őket, és szabad hozzáférést biztosítottak a táplálékhoz és a vízhez. Az egereket izoflurán túladagolással altatták el. Az East Carolina Egyetem intézményi felülvizsgálati bizottsága jóváhagyta az összes állatkísérleti eljárást és felhasználást. Az állatok gondozása megfelelt az Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és felhasználásához, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

FDB boncolás

Az FDB-t használó bármely eljárásnál kritikus fontosságú a gondos boncolás, amely megakadályozza az izom sérülését (az izmot sűrű kötőszöveti terület veszi körül) (lásd az 1. ábrát). A boncolás megkönnyítése érdekében a lábujjakat egy parafa táblára tűztük, rögzítve a lábfejet úgy, hogy a talp felfelé nézzen. Ezután a lábfej proximális végén (a lábszárcsont felett) a bőrt megcsíptük, hogy mikroollóval bemetszéseket ejthessünk a lábfej oldalsó szélei mentén egészen a lábujjakig. A bőrt a sarokcsont felett még mindig megcsípve mikroollóval elválasztottuk a bőrt az alatta lévő izomzatról. A megmaradt bőrlebenyt visszahúztuk és eltávolítottuk, hogy feltárjuk a lábujjak FDB-jét és inait. Ezután a proximális inat elvágtuk, és miközben az inat csipesszel tartottuk, az FDB-t levágtuk az alatta lévő fasciáról. Ezután a lábujj inakat átvágtuk, hogy az FDB-t kiszabadítsuk a lábfejből.

Myofiberek izolálása

A FDB felboncolása után az izmokat friss táptalajba helyeztük (DMEM glutaminnal, 2% steril-szűrt FBS, 0.1% gentamicin), kiegészítve 4 mg/ml kollagenáz A-val (Roche – 11088793001) 90-120 percig 37 °C-on, 5% CO2 -ban, a korábban leírtak szerint. Az FDB-izmot 2 ml kollagenáz nélküli táptalajba helyeztük, és egy P1000 pipettahegy levágott végével óvatosan a tál falának ütögettük, hogy a rostokat kiszabadítsuk a kötegből. Az izolált myofibrillákat entaktin-kollagén-lamininnel (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore) bevont üvegfenekű edényekre ragasztottuk. A rostokat néhány órára 37 °C-ra, 5% CO2-be helyeztük vissza, majd az alábbiakban leírtak szerint képet készítettünk róluk.

FDB izomrostok hossza

A hím és nőstény C57BL/6 egerek FDB izmait a proximális ínnál és három medialis lábujjínnál selyemvarrással összekötöttük, és a nyugalmi feszültség fenntartása érdekében fémkapocshoz rögzítettük. A mioszöveteket a fent leírt módon izoláltuk, de nem ragasztottuk üvegfenekű lemezekre. A mioszöveteket ×4-es objektívvel, EVOS XL magmikroszkóppal és a hozzá tartozó szoftverrel (Life Technologies, Bothell, WA) képeztük le. Körülbelül 1000 myofíber hosszát mértük meg az ImageJ programban (1.6.0 verzió, NIH, Bethesda, MD). Izoláláskor a mioszálak már nem voltak feszültségben, ezért nem az optimális hosszúságot képviselték. A myofiberek hosszában bekövetkezett változás figyelembevételéhez a szarkomer hosszát használva egy átváltási tényezőt alkalmaztunk, ahogyan azt korábban Dr. Richard Lieber leírta. Optimális hosszúság esetén a feltételezett egérizom optimális szarkomer hossza egy myofiber esetében 2,5 μm átmérőjű . A myofiberek hosszának a szarkomer hosszához való normalizálásához megmértük a szarkomer hosszát egy 30 myofiberből álló részhalmazban. Minden egyes myofiber 10 szarkomerje közötti távolságot megmértük, és kiszámítottuk a 30 myofiber átlagos szarkomerhosszát. Az optimális szarkomer hossz (2,5 μm) osztva az átlagos mért szarkomer hosszal 1,14-es konverziós tényezőt eredményezett, amelyet az összes mért myofiber hosszának optimális szarkomer hosszra való normalizálásához használtunk.

Egyéni száltípus és szálkaméret

Az FDB izomrosttípus elemzését C57BL/6 egerekből származó mintákon végeztük, a korábban leírtak szerint . A metszeteket az I. típusú myozin nehézlánc (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) és anti-dystrophin (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA) elleni primer antitestekkel vizsgáltuk, majd EVOS FL auto mikroszkóp és a hozzá tartozó szoftver (Life Technologies, Bothell, WA) segítségével képet készítettünk. A rosttípust és a rostok keresztmetszeti területét (CSA) az ImageJ segítségével értékeltük, a korábban leírtak szerint.

Izometrikus erőtermelés

Az izometrikus erőtermelést és a fáradást C57BL/6 egerek EDL (n = 5), soleus (n = 4) és FDB (n = 6) izmaiban értékeltük, a korábban leírtak szerint, kisebb módosításokkal. Az FDB-t feltártuk, és a proximális inat selyemvarrással rögzítettük. Finom hegyű csipeszt helyeztek a három medialis lábujjín alá, és finoman lehúzták a lábujjak felé, mielőtt a három inat (1. ábra) selyemvarrással rögzítették. Azért kötöttük meg a három medialis inat, mert az anatómiai elhelyezkedés miatt az egyik lábujjat nem lehet megkötni, és a negyedik ín megkötése tapasztalataink szerint nem eredményez eltérő abszolút erőt (az adatok nem láthatóak). Ezután mindegyik inat közvetlenül a csomó felett elvágtuk, és az FDB-t óvatosan leemeltük a lábfejről. Mikroollót használtunk a megmaradt kötőszövet eltávolítására, a lábfejről való leválasztásra. Az izmot ezután egy erőmérőhöz kötöttük, és oxigénnel dúsított Krebs Ringer pufferben (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) szobahőmérsékleten felfüggesztettük. Ezután az izom hosszát addig állítottuk be, amíg az FDB rántási csúcserőt nem produkált, ekkor állítottuk be az optimális nyugalmi feszültséget (Lo), és hagytuk, hogy az izom 10 percig egyensúlyba kerüljön. A soleus-izmokat úgy készítettük elő, hogy a distalis soleus-ínnál kettős négyzetes csomót kötöttünk. Az inat a csomó felett elvágtuk, és a hátsó izmokat óvatosan elhúztuk a lábtól, felfedve a proximális soleus-ínt, amelyet kettős négyzetes csomóval kötöttünk. Az EDL-t a korábban leírtak szerint boncoltuk és kötöttük meg. Az EDL és a soleus izmokat 10 percig oxigéndús, szobahőmérsékletű KRB-ben nyugalmi feszültség mellett egyensúlyba hoztuk. Az egyensúlyozás után az izomfeszültséget maximális rángatózási ingerléssel és az izomhossz beállításával optimalizáltuk a csúcserő eléréséig. A rángatózási ingereket 30 s különbséggel végeztük, hogy elkerüljük az izom kifáradását. Ezután az izmokat 60 másodpercenként 10, 20, 40, 60, 80, 100 és 120 Hz-es frekvenciával stimuláltuk az erőfrekvencia-görbe létrehozásához. Az izmokat további 1 percig pihentettük, mielőtt egy 10 perces ingerlési protokollt végeztünk volna a fáradási ellenállás meghatározásához. A fáradási protokoll 2 másodpercenként 30 Hz-en stimulálta az izmokat 600 másodpercen keresztül, összesen 300 összehúzódás erejéig. Az optimális izomhosszúságot feljegyeztük, és az izmokat a mérlegelés előtt a felesleges KRB eltávolítása érdekében letöröltük. A kísérletek előtt 20 V optimális feszültséget állapítottunk meg, hogy biztosítsuk az FDB, EDL és soleus maximális stimulációját (az adatok nem láthatóak). Az abszolút izomerő-adatokat fajlagos erővé (N/cm2 ) alakítottuk át az izom CSA és a fiziológiai keresztmetszeti terület (PCSA) matematikai becslésére szolgáló, korábban leírt egyenletek segítségével. A CSA és a PCSA közötti elsődleges különbség az izomrostok hosszának és az izomhossznak a PCSA egyenletben való figyelembevétele. Az irodalommal való szélesebb körű kompatibilitás érdekében mindkét korrigált módszert alkalmaztuk.

Passzív kontraktilis tulajdonságok

A passzív kontraktilis tulajdonságokat C57BL/6 hím egerek EDL és FDB izmaiban (n = 4) a korábban leírtak szerint, kisebb módosításokkal értékeltük. Az EDL és FDB izmokat feldarabolták és a fent leírtak szerint erőátalakítóhoz kötötték. Az izmokat 10 percig oxigénnel telített KRB-ben, szobahőmérsékleten egyensúlyoztuk. Az egyensúlyozás után az izomfeszültséget maximális rángatózási ingerek végrehajtásával és az izomhossz beállításával optimalizáltuk, amíg a maximális erőt el nem értük. A rángatózási ingereket 30 s különbséggel végeztük, hogy elkerüljük az izom kifáradását. Az izom referenciahosszát a Lo értékeként mértük, mielőtt a Lo 105, 110, 115, 120, 125 és 130%-ának megfelelő passzív nyújtásnak vetettük alá. Az izmokat megtisztítottuk a felesleges KRB eltávolítása érdekében, majd megmértük. Az adatokat korrigáltuk a CSA-ra és a PCSA-ra.

Kardiotoxin (CTX) sérülés

C57BL/6 egereken összehasonlításokat végeztünk CTX-kezelt FDB (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) és PBS-kezelt kontralaterális FDB között 4 nappal (n = 4) és 10 nappal a kezelés után (n = 2). Steril 8 mm hosszúságú 31G fecskendőket készítettünk 10 μL 10 μM CTX-et vagy 10 μL steril 1× PBS-t a korábban leírtak szerint . Az izoflurán-indukált érzéstelenítést követően négy egér lábfejét alkoholos törlőkendővel megtisztítottuk. A CTX-et a lábfej proximális részébe adtuk be úgy, hogy a tűt a bőr alá, a lábujjak felé helyeztük. A kontralaterális lábfejbe PBS-t fecskendeztünk. Az egereket a megfelelő időben feláldozták, és az FDB-ket a fent leírtak szerint boncolták fel az erőkifejtés méréséhez. Az adatokat PCSA-ra korrigáltuk.

Hematoxilin és eozin festés

A 10 napos CTX kezelésnek kitett FDB izmokat optimális vágási hőmérsékletű (OCT) oldatban gyorsfagyasztottuk a metszéshez és H&E festéshez, a korábban leírtak szerint.

Vázizomzat nagy felbontású mitokondriális rezpirometriája

Permeabilizált gastrocnemius és FDB izomrostkötegek előkészítése

A rezpirometriát C57BL/6 egerek (n = 4) azonos végtagjából kivágott izolált permeabilizált gastrocnemius és FDB izomkötegeken végeztük. A vörös gastrocnemius egy részét felboncoltuk és a permeabilizált rostkötegek előkészítéséhez használtuk, a korábban leírtak szerint . A vörös gastrocnemius izmot használtuk összehasonlító szövetként, mivel általában ezt használják az egér vázizomzat mitokondriális légzésének értékelésére . A permeabilizált FDB izomrostkötegek előállításának protokollját a vörös gastrocnemius izomkötegek permeabilizálására korábban leírt módszerekből adaptáltuk, és az alábbiakban ismertetjük. Az FDB-ket felboncoltuk, és azonnal jéghideg X pufferbe (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurin, 5,7 ATP, 14,3 foszfokreatin, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O) helyeztük. Boncoló mikroszkóp segítségével óvatosan eltávolítottuk a kötőszövetet, a zsírt és az ereket, hogy elkerüljük az izomveszteséget. Az FDB-ket kötegekre vágtuk és három-négy kötegből álló, 1,5-2,0 mg nedves tömegű csoportokra osztottuk. A kötegcsoportokat ezután 22,5 μg/ml szaponin tartalmú X pufferben permeabilizáltuk folyamatos forgatás mellett 4 °C-on 5 percig. Az izomkötegeket azonnal átvittük jéghideg Z pufferbe (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) és 15 percig 4 °C-on folyamatos forgatással mostuk.

Mitokondriális légzés

A nagy felbontású O2-fogyasztás mérése az OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Ausztria) segítségével történt 37 °C-on, ~ 300-350 μM kiindulási oxigénkoncentrációval, a korábban leírtak szerint . A kísérleteket 20 mM kreatin-monohidrátot és 25 μM blebbisztatint tartalmazó Z pufferben végeztük. A mitokondriális légzést szubsztrátok szekvenciális hozzáadásával vizsgáltuk, a következő végső koncentrációban: piruvát 4 mM, malát 0,5 mM, glutamát 5 mM, ADP 2 .5 mM, szukcinát 5 mM, citokróm c 5 μM, rotenon 10 μM, antimicin A 5 μM, aszkorbinsav 2 mM és TMPD 0,5 mM (N,N,N,N′,N′-tetrametil-p-feniléndiamin-dihidroklorid). A mitokondriális membrán integritását a gastrocnemius izomkötegek és az FDB izomkötegek kizárásával igazoltuk, amelyeknél a légzés > 10, illetve > 20%-os növekedése következett be az exogén citokróm c hozzáadását követően. A gastrocnemius és az FDB izomkötegek esetében eltérő kizárási kritériumokat alkalmaztunk, mivel az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy a citokróm c hozzáadását követően az FDB rostkötegekben a légzés nagyobb százalékos növekedése volt jellemző, mint a gastrocnemius rostkötegekben. A protokoll befejezése után az izomkötegeket desztillált H2O-ban öblítettük, fagyasztva szárítottuk (Labconco, Kansas City, MO) és megmértük (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Az ép gastrocnemius izomkötegek légzési sebességét általában a száraz tömegre korrigálják; a két izomcsoport kötőszövet-tartalmának különbségei miatt azonban a JO2 értékeket az összes fehérjére és a citrát-szintáz (CS) aktivitásra is korrigáltuk. A CS-aktivitást a CS0720 készlet segítségével mértük. A vegyszereket és reagenseket a Sigma Aldrich-tól vásároltuk.

Mikroszkópia

In vitro

Az FDB izomrostokat C57BL/6 egerekből izoláltuk és 35 mm-es, ECL-lel bevont üvegfenekű edényekre rögzítettük, a korábban tárgyaltak szerint. Az izolált myofibrillákat DMEM-ben mitotracker deep red (M2246, Thermo Fisher) és NucBlue (R37605, Thermo Fisher) festékkel festettük 30 percig. A rostokat háromszor mostuk 2 mL KRB-vel. A szálakat egyfotonos konfokális lézerpásztázó mikroszkóppal képeztük le, ×60-as olajimmersziós objektívvel (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35), a gerjesztés pedig egy többsoros argonlézer 405 és 488 nm-es vonalaival történt.

In vivo

A második harmonikus generáció azt az optikai hatást írja le, amely a lézerimpulzusok erősen polarizált, nem centroszimmetrikus anyagokon, például a miozinon való áthaladásakor keletkezik. A megfelelő hullámhosszon polarizálva ezek az anyagok a belépő hullámhossz felénél bocsátanak ki fényt, így nagy felbontású képeket állítanak elő a fotobleachingnak és fototoxicitásnak kitett fluoreszcens szondák nélkül. Továbbá, az alkalmazott közeli infravörös hullámhossz lehetővé teszi a mély szöveti behatolást invazív eljárások nélkül. A C57BL/6 egereket érzéstelenítették, mielőtt az FDB-t fedő bőrt eltávolították volna, felfedve az FDB-izmot. Miután feltárták, az FDB-t steril KRB-vel hidratálták, és az egeret hason fekve egy üveglapra (#1.5, Leica) fektették, a korábban leírtak szerint (1C ábra). A miozin és nikotinamid-tartalmú molekulákat 900 és 720 nm-en gerjesztettük egy üzemmód-zárolt Ti:Sapphire impulzuslézerrel (Mai Tai Deep See HP sorozat, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), és az emissziót egy FV10 MRV/G szűrővel 450, illetve 420 nm-re állított, nem letapogatott detektálással rögzítettük. Minden képet ×60-as olajimmersziós objektívvel (Plan Apochromat, NA 1,35) és az FV10-ASW 4.2 felvételi szoftverrel működő Olympus FV1000 LSM készülékkel készítettünk.

A Pgc1α-t overexpresszáló vázizomzat DNS-elektroporációja és nagy felbontású rezpirometriája

A cDNS FDB-kbe történő elektroporációját a korábban leírtak szerint végeztük. Röviden, hét C57BL/6 hím és nőstény érzéstelenített egér lábát alkoholos törlőkendővel megtisztítottuk, és a lábpárnákba 10 μl 2 mg/ml hialuronidázt szuszpendáltunk steril szűrt KRB-ben egy 8 mm hosszú 31-es steril tű segítségével. Körülbelül 1 órával később az egereket másodszor is elaltatták. A lábakat ismét megtisztítottuk alkoholtörlővel, majd az egyik láb 30 μg zöld fluoreszcens fehérje (GFP) jelölésű PGC1α plazmidot kapott, a kontralaterális lábra pedig YFP cDNS-t injektáltunk. Az altatásból való teljes felépülést követően az egereket ~ 10 perc múlva harmadszor is elaltattuk. Platina elektródákat helyeztünk a bőr alá, és azokat az FDB-re merőlegesen és egymással párhuzamosan helyeztük el a saroknál és a lábtőnél a lábujjak alatt. Az FDB-t 20 darab 20 ms időtartamú, 1 Hz-es és 100 V-os impulzusokkal stimuláltuk. Az egereket 14 nappal később feláldozták, és az FDB-ket felboncolták és fluoreszcens mikroszkóp alatt leképezték a plazmid expresszió megerősítésére. Ezután intakt FDB izommintákat készítettünk, és a mitokondriális légzést mértük a fentiek szerint.

Statisztikák

Az adatok eloszlását értékeltük, és a normális eloszlásnak nem megfelelő adatokat log 10 bázisú transzformáltuk. Az erőfrekvenciás összehúzódási adatokat kétirányú ANOVA-val elemeztük Tukey többszörös összehasonlításokkal. Az izomtömeget, a rosttípust, a maximális és fél-relaxációs időt és a fáradási adatokat egyirányú ANOVA-val elemeztük Tukey többszörös összehasonlításokkal. Azokban az esetekben, amikor az adatokat nem lehetett normális eloszlásra transzformálni, Kruskal-Wallis tesztet végeztünk Dunn többszörös összehasonlításokkal. Az ANOVA-kat a GraphPad Prism 7.03 alkalmazásával végeztük el. A légzési adatokat és a CS-aktivitást párosított kétfarkú t-tesztekkel elemeztük 0,05-ös alfa-szinttel a Microsoft Excel segítségével. Minden adatot átlag ± SEM-ben mutatunk be.