A medúzák genomjának összeállítása és annotálása

Itt bemutatjuk a Nomura medúza (Nemopilema nomurai; 1b ábra) első de novo genom-összeállítását. Az eredmény egy 213 Mb-os, 255 scaffoldból álló, 2,71 Mb N50 hosszúságú, mindössze 1,48%-os hézagokat tartalmazó 213 Mb-os genom volt (Additional file 1: S2 és S3 táblázatok). A Nemopilema hibrid összeállítása rövid és hosszú olvasási szekvenálási technológiák kombinációjával készült, amely 38,2 Gb Pacific Biosciences (PacBio) egymolekulás valós idejű szekvenálási (SMRT) olvasásból, valamint 98,6 Gb Illumina rövid beillesztésű, párosított és TruSeq szintetikus hosszú olvasásból állt (Additional file 1: S3-S5 ábrák; S4-S7 táblázatok). Az így kapott összeállítás a leghosszabb folytonosságot mutatja a cnidáriák genomjai között (Additional file 1: Table S9). 18 962 fehérjét kódoló medúzagént jósoltunk meg de novo (a medúzaharang és a csápszövet transzkriptomjainak felhasználásával) és homológ gén-előrejelzési módszerek kombinálásával (Additional file 1: S10 és S11 táblázatok, Additional files 2 és 3). Ez az eljárás az összes eddig publikált, nem bilaterális metazoák genom-összeállításai közül a legnagyobb számú egykópiás ortológ gént állította helyre (Additional file 1: S12 táblázat). A medúza genomjának összesen 21,07%-át találtuk transzponálható elemekből állónak, szemben az Acropora digitifera (9,45%), a Nematostella vectensis (33,63%) és a Hydra vulgaris (42,87%) genomjával (Additional file 1: Table S13).

A Nemopilema genomot összehasonlítottuk más cnidariák genomjaival, beleértve a nemrég közzétett Aurelia aurita és Clytia hemisphaerica genomokat , amelyek mindegyike túlnyomórészt szesszilis taxonoktól származik, hogy felderítsük az egyedi Scyphozoa funkciót (aktív mobilitás), fizikai szerkezetet (medúzaharang) és kémiát (méreg). Mind a Nemopilema nomurai, mind a Sanderia malayensis medúza három medúzaszövet-típusra és négy fejlődési stádiumra kiterjedő transzkriptom-elemzéseket is végeztünk.

A medúzák evolúciós elemzése

A medúzákra jellemző evolúciós tulajdonságok azonosítására egy egysejtű holozoán és 13 metazoán géncsalád bővülését és szűkülését vizsgáltuk 18 458 ortológ géncsalád segítségével (lásd Additional file 1: Section 4.1). Ezek közül 10 434-et a Nemopilemában találtunk, 6764-et pedig mindhárom rendelkezésre álló naspolya osztályban (Scyphozoa: Nemopilema nomurai és Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera és Nematostella vectensis ; 2a. ábra). Az ezen ortológok felhasználásával felépített filogenia egy monofiletikus cnidariák kládját mutatta ki, amely a kétéltűek evolúciója előtt vált el a metazoák törzsétől (2b. ábra; Additional file 1: S7 ábra). Annak meghatározására, hogy az egyes evolúciós korszakokban hány gén jelent meg a Nomura-medúza genomjában, a fehérjekódoló gének evolúciós korát is értékeltük. A medúza génjeit három nagy evolúciós korszakba csoportosítva megfigyeltük, hogy míg a gének többsége (80%-a) ősi (741 Mya-nál idősebb), néhány (~ 3%) köztes korú (741-239 Mya), néhány (17%) pedig fiatal (239 Mya-tól napjainkig; 2c. ábra; Additional file 1: S10 ábra). Érdekes módon a gének számát az evolúciós korszak kora és hossza szerint normalizálva azt sugalljuk, hogy a génforgalom a jelen kor közelében a legnagyobb. Összességében a Nemopilema genomja 123 bővült és 164 zsugorodott géncsaládot tartalmazott a Nemopilema és az Aurelia közös őséhez képest (2b. ábra; lásd Additional file 1: 4.2. szakasz). Az érzékszervi érzékeléssel kapcsolatos Gene Ontology (GO) kifejezések alulreprezentáltak voltak a Cnidaria vonalban a Bilateria vonalhoz képest, ami pontosan tükrözi a cnidariák kevésbé összetett érzékszervi rendszerét (Additional file 1: S14 és S15 táblázatok). A neurotranszmitter-transzport (GO:0006836, P = 6,01E- 10) azonban szignifikánsan feldúsult a Scyphozoa vonalban a Scyphozoa és Hydrozoa közös őséhez képest (Additional file 1: S16 és S17 táblázatok), valószínűleg az egyensúly és a vizuális struktúrák, például a statociszta és az okcellák miatt, amelyek a mobil medúzákban sokkal kidolgozottabbak, mint a szessilis polipokban . A Nemopilema és az Aurelia közös őséhez képest a Nemopilema a metallopeptidáz aktivitással összefüggő géncsaládok bővülését mutatta (GO:0008237, P = 2,86E- 14; Additional file 1: S18 és S19 táblázatok). Emellett 1589 ortológ géncsaládot találtunk, amelyek specifikusak a Scyphozoa-ra. A szkíphozoa-specifikus gének gazdagodási tesztjei a nátriumion-transzport, az ioncsatorna-aktivitás és a neurotranszmitter-receptor-aktivitás kifejezéseit mutatták (Additional file 1: Table S20).

Genomikai kontextus és izomhoz kapcsolódó gének

A medúzáknak két elsődleges izomtípusuk van: Az epitheliomuszkuláris sejtek, amelyek a szesszilis cnidariák uralkodó izomsejtjei, és a medúza harangjában található harántcsíkolt izomsejtek, amelyek az úszáshoz nélkülözhetetlenek. Hogy megértsük az aktív úszás evolúcióját a medúzáknál, más metazoákhoz képest megvizsgáltuk a kodon-eltérésüket a harmadik kodonpozíció (GC3) guanin- és citozintartalmának kiszámításával (Additional file 1: Figure S13). Azt feltételezték, hogy a magas GC3-tartalmú gének jobban alkalmazkodnak a külső stresszhatásokhoz (pl. környezeti változásokhoz) . A magas pontszámú top 100 GC3 elfogult gén, az izomösszehúzódás szabályozása és a neuropeptid jelátviteli útvonalak GO-termei között a Nemopilemára specifikusak voltak (Additional file 4: S25 és S26 táblázatok). A kalcium kulcsszerepet játszik a medúzák harántcsíkolt izmainak összehúzódásában, és a kalcium jelátviteli útvonal (GO:0004020, P = 5,60E- 10) magas szintű, Nemopilema-specifikus GC3 elfogultságot mutatott. A Nemopilema és az Aurelia top 500 GC3 génje a homeosztázissal kapcsolatos GO-terminusokban gazdagodott (pl, sejtszintű kémiai homeosztázis és nátriumion-transzport), ami feltételezésünk szerint elengedhetetlen a medúzák mozgó ragadozó mozgását működtető izomösszehúzódások aktiválásához (Additional file 1: Section 5.1; Additional file 4: Tables S27 and S28).

Mivel a cnidariákról azt jelentették, hogy nem rendelkeznek titin és troponin komplexekkel, amelyek a kétéltűek harántcsíkolt izmainak kritikus összetevői, azt feltételezték, hogy a két klád egymástól függetlenül fejlesztette ki a harántcsíkolt izmokat . A cnidariák izomszerkezeti és szabályozó fehérjéket kódoló génjeinek áttekintése kimutatta, hogy a kétéltűekkel közös, konzervált eumetazoaiaktin-myozin kontraktilis gépezet van (Additional file 1: Table S32). Más cnidariákhoz hasonlóan azonban a Nemopilemából is hiányoznak a titin és troponin komplexek, amelyek a kétéltűek harántcsíkolt izmainak kulcsfontosságú összetevői. A γ-szintrofin, a dystroglycan komplex egyik összetevője szintén hiányzott a Nemopilemából, az Aureliából és a Hydrából. A Nemopilema és az Aurelia azonban rendelkezik α/β-Dystrobrevin és α/ε-Sarcoglycan dystroglycan-associated costamere fehérjékkel, ami azt jelzi, hogy a dystroglycan komplex számos összetevője elveszett a Scyphozoa-Hydrozoa szétválás után. Felvetődött, hogy a Hydra másodlagos egyszerűsítéseken ment keresztül a Nematostellához képest, amely nagyobb fokú izomsejt-típusú specializációval rendelkezik . A Hydra-hoz és a Nematostella-hoz képest a Nemopilema és az Aurelia az izomszerkezeti és szabályozó fehérjék köztes komplexitását mutatja a Hydra és a Nematostella között.

Medúza harang és csáp transzkriptom profilozása

A medúzák medúza harangja és csápja morfológiailag különbözik és különálló fiziológiai funkciókat lát el . A Nemopilema és a kisebb, laboratóriumban tenyészthető Sanderia malayensis harang és csáp transzkriptomokat hoztunk létre a fejlődési szabályozás értékeléséhez (Additional file 1: Table S29). A magasan expresszálódó gének gazdagodási tesztjei azt mutatták, hogy az izomhoz kapcsolódó funkcionális kategóriák (pl. izom-miozin komplex és izomszöveti morfogenezis) feldúsultak a harangban (3a. ábra; 5. kiegészítő fájl: S30-S33 táblázatok). A miozinok a motoros fehérjék szupercsaládját alkotják, és kritikus szerepet játszanak az izomösszehúzódásban, valamint a motilitási folyamatok széles skálájában vesznek részt az Eukariótákban. Kritikusan fontos, hogy a Myosin II család fehérjéi, amelyek mind a harántcsíkolt izomszövet, mind a simaizomszövet sejtjeiben megtalálhatók, felelősek az izomsejtek összehúzódásáért . A cnidariák mind hámizomsejtekkel, mind harántcsíkolt izomsejtekkel rendelkeznek. A harántcsíkolt izomzat a medúza harangjának kritikus alkotóeleme, ahol gyors összehúzódásai a medúza egyedülálló, meghajtáson alapuló úszását hajtják. Megállapítottuk, hogy a II. típusú Myosin nehézlánc (MYH) és Myosin könnyűlánc (MYL) géncsaládok nagymértékben kifejeződtek a harangban, és szorosan kapcsolódnak a harántcsíkolt és simaizomsejtekhez . Érdekes módon a Nemopilema és az Aurelia mutatta a MYH és MYL gének legnagyobb kópiaszámát a nem bilaterális metazoák között (3c. ábra; Additional file 1: S14-S17 ábrák; S38-40 táblázatok), és a Nemopilema hét MYH génje közül hat és a 21 MYL génből 12 magasabb expressziót mutatott a harangban, mint a csápokban, nagyon magas, ~ 8,8 és ~ 17-szeres átlagos növekedéssel (3d. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a II. típusú Myosin géncsaládok kópiaszám-expanziójának és az izomhoz kapcsolódó gének magas expressziójának kombinációja megerősítette, hogy a medúza harangjában az izomzat a medúza mozgékonyságának fontos meghatározója.

A csápok génexpressziós elemzései ezzel szemben a neurotranszmitterekkel kapcsolatos funkcionális kategóriák (ioncsatorna-komplex, posztszinapszis és neurotranszmitter-receptor-aktivitás; ábra. 3b; Additional file 5: Tables S34-S37); összhangban a medúzacsápok anatómiájával, amelyek az érzékelő sejteket és a neuronális alpopuláció laza plexusát tartalmazzák az ektoderma tövében .

A test mintázata a medúzákban

A test mintázatának korai evolúciója körül a metazoák közös ősében sok vita folyt, különösen a Hox és Wnt géncsaládok eredetét és terjedését illetően . A Nemopilemában összesen 83 homeodomént találtak, míg az Aureliában, Hydra-ban, Acroporában és Nematostellában 82, 41, 120 és 148 homeodomént (Additional file 1: Table S41). A Nemopilema nyolc Hox-génje közül öt a hátsó típusba tartozik, amelyek az aborális tengely fejlődéséhez kapcsolódnak, és a Nematostella hátsó Hox-génjeivel, a HOXE és HOXF génekkel klasztereződtek (Additional file 1: S18-S20 ábrák). Az Aurelia hat hátsó típusú Hox-génnel rendelkezik, de nem rendelkezik a HOXB, C és D típusú génekkel (HOX2 az emberben). Bár a Hydra és az Acropora hiányzik, a Nemopilema ParaHox génjeinek szünteniaelemzései azt mutatják, hogy az XLOX/CDX gén közvetlenül a GSX után helyezkedik el, ugyanabban a tandemorientációban, mint a Nematostella génjei, ami arra utal, hogy az XLOX/CDX jelen volt a cnidáriák közös ősében, majd néhány vonalban elveszett (Additional file 1: S21 ábra). A Hox-szal kapcsolatos gének, az EVX és az EMX szintén jelen vannak a Nemopilemában és az Aureliában, bár a Hydra-ban hiányoznak. Tekintettel a Wnt-gének nagyfokú ősi diverzitására, azt javasolták, hogy a Wnt-szignalizáció irányította a testfelépítés fejlődését a korai metazoáknál . A Nemopilema 13 Wnt ortológgal rendelkezik, amelyek 10 Wnt alcsaládot képviselnek (Additional file1: Figure S22; Table S42). A Wnt9 hiányzik az összes haslábúból, ami valószínűleg a haslábúak közös ősének veszteségeit jelenti. A cnidariák dinamikus, vonal-specifikus Wnt-alcsalád-duplikációkon mentek keresztül, mint például a Wnt8 (Nematostella, Acropora és Aurelia), Wnt10 (Hydra) és Wnt11, valamint Wnt16 (Nemopilema és Aurelia). Azt javasolták, hogy a Wnt-gének közös klasztere (Wnt1-Wnt6-Wnt10) létezett az ízeltlábúak és a deuterosztómák utolsó közös ősében . A cnidáriák és kétéltűek genomjainak elemzéséből kiderült, hogy az Acropora is rendelkezik ezzel a klaszterrel, míg a Nemopilema, Aurelia és Hydra esetében hiányzik a Wnt6, ami a Wnt6 gén elvesztésére utal a Medusozoa közös ősében (Additional file 1: Figure S23). Összességében a medúzák más cnidariákhoz hasonló számú Hox- és Wnt-génnel rendelkeznek, de e géncsaládok dinamikus repertoárja arra utal, hogy a cnidariák egymástól függetlenül fejlődtek ki fiziológiai jellemzőik és életciklusuk adaptálása érdekében.

Polipból medúzába való átmenet a medúzákban

A polipból medúzába való átmenet a medúzákban a többi szessilis cnidariához képest kiemelkedő. A medúzák medúzaszerkezetének kialakulása genetikai alapjainak megértése érdekében összehasonlítottuk a transzkripciós szabályozást a cnidariák között és a medúzák különböző fejlődési stádiumaiban (lásd Additional file 1: 7.1. és 7.2. szakasz). A Sanderia transzkriptomokat hat összevont transzkriptom minta segítségével állítottuk össze (Additional file 1: Table S43). Az összeszerelt transzkriptek teljes hossza 61 Mb volt, és 58 290 transzkript izoformát és 43 541 egyedi transzkriptet eredményezett, 2325 bp N50 értékkel. Átlagosan az RNS-olvasatok 87%-a illeszkedett az összeállított transzkriptekhez (Additional file 1: Table S44), ami azt jelzi, hogy a transzkript-összeállítás a szekvenált olvasatok többségét képviselte. Továbbá a Nemopilema és a Sanderia között meglehetősen hasonló volt az első 20 helyezett fehérjetartomány összetétele (Additional file 1: S45. táblázat). Az egyes stádiumokra vonatkozó differenciálisan expresszált gének meghatározásához az egyes stádiumokat a medúzák életciklusának előző vagy következő szakaszával hasonlítottuk össze. A polip-stádiumban, amely a medúza életciklusának szesszilis szakaszát képviseli, az ioncsatorna-aktivitással és az energia-anyagcserével (metabolikus folyamatok szabályozása és aminocukor-anyagcserefolyamat; Additional file 1: Table S46) kapcsolatos kifejezések feldúsulását tapasztaltuk. Az aktív táplálkozás a polipban serkenti az aszexuális szaporodást vagy több polippá, vagy a metamorfózist strobilává . Mivel az anthozoák nem alkotnak medúzát, a strobila aszexuális szaporodási stádiuma fontos szakasz a polipból medúzává történő metamorfózis tanulmányozásához. Ebben a stádiumban az amid bioszintetikus és metabolikus folyamatokhoz kapcsolódó GO-terminusok a polip stádiumhoz képest magasan kifejeződtek (Additional file 1: Table S47). Arról számoltak be, hogy az RF-amid és LW-amid neuropeptidek a cnidariák metamorfózisához kapcsolódnak . Ezt a megállapítást azonban nem tudtuk megerősíteni a strobila és ephyra stádiumú összehasonlításainkban. A mi rendszerünkben a két stádium génexpressziós mintázata meglehetősen hasonló. Az ephyra, a szabaddá vált mobilis stádiumban az amid bioszintetikus és metabolikus folyamatokat érintő GO-terminusok is magasan kifejeződtek az összevont medúza stádiumhoz képest (Additional file 1: Table S48). A medúzában az extracelluláris mátrix, a metallopeptidáz-aktivitás és az immunrendszeri folyamat kifejezések feldúsultak (Additional file 1: Table S49), ami összhangban van a harang, a csápok és a szájkarok szövettípusainak fiziológiájával.

A polipból medúzába történő metamorfózisról korábban kimutatták, hogy erősen összefügg a CL390 és a retinoid X receptor (RXR) génekkel az Aurelia aurita medúzában . Érdekes módon a CL390-et nem találták meg a Nemopilemában vagy más publikált cnidariákban, ami arra utal, hogy ez egy Aurelia-specifikus strobilizáció indukáló gén lehet. Megerősítettük azonban, hogy az RXR jelen van a Nemopilemában, és hiányzik a medúza-stádium nélküli cnidariákból (Additional file 1: Figure S24). A retinsav (RA) jelátvitel központi szerepet játszik a gerincesek növekedése és fejlődése során , ahol a közeli célgének RA-válasz elemeihez (RARE) kötött RA-receptorral (RAR) kölcsönhatásba lépve szabályozza a transzkripciót. Az RA jelátviteli útvonal génjei közül a Nemopilema rendelkezik ADH és RALDH enzimekkel, amelyek a retinolt RA-vá metabolizálják, valamint RXR-rel és RARE-okkal a célgének transzkripciójának aktiválásához (4a. ábra). 1630 Nemopilema RARE régiót fedeztünk fel, amelyek átlagos távolsága 13 Kbp volt a legközelebbi géntől (4b. ábra; Additional file 1: S50 és S51 táblázatok). Érdekes módon a Nemopilema négy hátsó Hox-génje és az Aurelia két Hox-génje ± 10 Kbp távolságon belül helyezkedett el a RARE-ektől, ami egyedülálló a nem bilaterális metazoák között (4c. ábra; Additional file 1: S52 táblázat). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a korai metazoáknál jelen volt a retinsav jelátvitel a célgének RXR-rel és RARE-okkal történő szabályozására, és hogy az RXR és a RARE-ok kritikus szerepet játszhatnak a polipból medúzává történő metamorfózisban .

Toxinokkal kapcsolatos domének azonosítása medúzákban

A medúzák fehérjetartalmú mérgek komplex keverékét termelik az aktív zsákmányszerzés és védekezés érdekében . Bőséges toxin doméneket azonosítottunk a Nemopilemában, ha összehasonlítjuk a Tox-Prot adatbázisban szereplő nem bilaterális metazoák génkészleteivel . Összesen 136 toxin doménből 67 illeszkedett a nem bilaterális metazoákhoz; ebből a 67 toxin doménből 52-t találtunk a Nemopilemában (Additional file 1: Table S53). Várhatóan a Nemopilema genomja tartalmazza a legtöbb méreghez vagy toxinhoz kapcsolódó domént a bevont nem bilaterális metazoák közül. E domének közé tartoznak a Reprolysin (M12B) családba tartozó cink-metalloproteáz (PF01421), foszfolipáz A2 (PF05826) és Prokineticin (PF06607) domének (5. ábra). Emellett a Nemopilema és az Aurelia 8, illetve 11 ShK-domén-szerű (PF01549) doménnel rendelkezik, amelyek más nem kétéltűekhez képest ezekben a fajokban fordulnak elő a legnagyobb számban. Különösen a Reprolysin (M12B) családba tartozó cink-metalloproteázok peptideket hasító enzimek, amelyek a legtöbb kígyóméreg endopeptidázt tartalmazzák . Továbbá arról számoltak be, hogy a szerin proteáz inhibitor és a ShK domének bőségesen megtalálhatóak mind az ágyúgolyós medúza (Stomolophus meleagris), mind a dobozmedúza (Chironex fleckeri) transzkriptomjában, és a foszfolipáz A2 egy jól jellemzett toxinnal kapcsolatos enzim, amely kritikus fontosságú a méregkomponensek előállításához, és a Scyphozoa osztályban található .

jelölik.