Abstract
A sejtek anyagcseréje a megfelelő intracelluláris szervetlen foszfát (Pi) koncentrációtól függ. Úgy tűnik, hogy a Pi éhezésre reagáló gének több anyagcsere-útvonalban is részt vesznek, ami egy komplex Pi szabályozási rendszerre utal a mikroorganizmusokban és a növényekben. A foszfátészterekből és anhidridekből felszabaduló foszfát felszívódásához és a megfelelő foszfátszint fenntartásához enzimek egy csoportja szükséges. A foszfatáz rendszer különösen alkalmas a szabályozási mechanizmusok tanulmányozására, mivel a foszfatáz aktivitás specifikus módszerekkel könnyen mérhető, és a foszfatáz aktivitás represszált és derepresszált szintje közötti különbség könnyen kimutatható. Ez a dolgozat a foszfátéhség során indukált fehérje-foszfatáz rendszert elemzi különböző organizmusokban.
1. Bevezetés
A sejtfolyamatok, mint például a sejtdifferenciálódás, a proliferáció, a sejthalál, a mobilitás, az anyagcsere, a túlélés és a citoszkeleton szerveződése, bizonyos ingerekre adott válaszként történő szabályozása alapvető fontosságú a sejtélet minden aspektusában . A fehérje-foszforiláció az egyik leggyakoribb mechanizmus, amelyet e folyamatok szabályozására használnak. A fehérje-foszforilációval reverzibilisen szabályozott folyamatokhoz fehérje-kinázra és fehérje-foszfatázra egyaránt szükség van .
Tradicionálisan a fehérje kinázokat intenzívebben tanulmányozták, mint a fehérje foszfatázokat, annak a korábbi nézetnek köszönhetően, hogy a fehérje kinázok finom szabályozást biztosítanak a fehérje foszforilációnak, míg a fehérje foszfatázok csupán a foszfátcsoportok eltávolítására szolgálnak. Csak az elmúlt évtizedben jöttek rá, hogy a fehérje-foszfatázokat is számos mechanizmus szabályozza, és nem kevésbé fontosak a sejtfiziológia szempontjából, mint a fehérje-kinázok. A fehérjefoszfatázok képesek hidrolizálni a foszfomonoészter-metabolitokat, felszabadítva a szervetlen foszfátot (Pi) ezekből a szubsztrátokból .
A foszfor szervetlen foszfát (Pi) formájában az egyik legfontosabb makrotápanyag minden szervezet számára . Nemcsak a sejtkomponensek, például az ATP, a nukleinsavak, a foszfolipidek és a fehérjék bioszintéziséhez használják fel, hanem számos anyagcsere-útvonalban is részt vesz, beleértve az energiaátvitelt, a fehérjék aktiválását, valamint a szén- és aminosav-anyagcsere-folyamatokat . A sejtek túléléséhez nagy mennyiségű foszfátra van szükség. A növényekben a Pi nélkülözhetetlen a növekedéshez és a fejlődéshez . Gombákban a Pi jelátviteli útvonal szabályozza számos foszfátra reagáló gén kifejeződését, amelyek részt vesznek az extracelluláris forrásokból történő pi-felvételben és a pi-felszívásban . A trypanosomatid parazitákban a Pi befolyásolja a gerinctelen gazdaszervezetben való megfelelő növekedési és kolonizációs képességüket .
Összefoglalva, a fehérje foszfatázok és kinázok szükségesek a Pi homeosztázisához a Pi megszerzése, tárolása, felszabadítása és metabolikus integrációja során . A dolgozat célja, hogy összefoglalja a foszfatázok szervetlen foszfát általi szabályozását, hangsúlyt fektetve ezen enzimek sejtbiológiában betöltött szerepére.
2. A foszfatázok szervetlen foszfát általi visszacsatolásos szabályozása: The PHO Pathway
Saccharomyces cerevisiae számos foszfatázzal rendelkezik, amelyek különböző specificitásúak, sejtes elhelyezkedésűek és a Pi felvételében használt permeázok. Az ezekért a tevékenységekért felelős génkészletet a növekedési közeg Pi-koncentrációja koordináltan represszálja . A Pi sejtszintű megszerzése, tárolása, felszabadítása és metabolikus integrációja számos alapvető enzim, például extracelluláris savas foszfatázok (APázok), foszfodiészterázok, Pi-transzporterek, polifoszfát-kinázok, alkalikus foszfatázok (ALPázok) és endopolifoszfatázok részvételét igényli . Ezen enzimek aktivitása szorosan kapcsolódik a Pi homeosztázishoz, és a változó Pi szintekre reagálva a Pi jelátviteli útvonalon (PHO) keresztül szabályozásnak vannak kitéve .
A PHO szabályozás egyik jelenlegi modelljében a PH04 gén által kódolt pozitív szabályozó (vagy pozitív faktor) Pho4p aktivitása és elhelyezkedése révén nélkülözhetetlen a PHO gének transzkripciós aktiválásához. Magas Pi közegben a Pho80p-ből és Pho85p-ből álló ciklinfüggő kináz (CDK) komplex hiperfoszforilációval gátolja a Pho4p működését. A hiperfoszforilált Pho4p a citoplazmában marad és nem képes aktiválni a PHO gének transzkripcióját . Ha a közegben a Pi koncentrációja elég alacsony, a Pho81p gátolja a Pho80p-Pho85p komplex működését , lehetővé téve a Pho4p számára, hogy a sejtmagba költözzön és aktiválja a PHO gének átírását . Ezek a gének kódolják a nagy affinitású transzportereket Pho84p és Pho89p; a szekretált savas foszfatázokat Pho5p, Pho11p és Pho12p; más kapcsolódó fehérjéket, amelyek növelik a Pi visszanyerését extracelluláris forrásokból .
Ezt a PHO útvonalat különböző organizmusokban, például növényekben , baktériumokban és gombákban írták le .
3. A foszfatáz rendszer az élesztőben
Először megfigyelték, hogy számos foszfatáz gént a táptalaj Pi koncentrációja módosítja; így a PHO útvonalat kezdetben a differenciálisan kifejeződő foszfatázokkal jellemezték .
A S. cerevisiae-ben a savas és lúgos foszfatázokat és a Pi transzportert kódoló gének átírása koordináltan represszálódik és derepresszálódik a táptalaj Pi koncentrációjától függően . A Pi limitáló körülmények között szintetizálódó foszfatázok többsége extracellulárisan helyezkedik el, vagy a plazmamembránhoz vagy a sejtfalhoz kapcsolódik .
A Pi-szabályozott foszfatáz gének közé tartozik a PHO5 , amely a represszálható savas foszfatázok (rAPáz; optimális pH 3-4; EC 3.1.3.2) fő frakcióját kódolja, valamint annak izoenzimjei, a PHO10 és PHO11 . Ez a három rAPáz glikoprotein, amelyek a sejtfalban vagy a periplazmatikus térben találhatók. Felelősek a foszfátmegkötésért, és nagy affinitású transzporterekkel együttműködve foszfátot vesznek fel, amikor a környezet Pi-koncentrációja alacsony . A PHO5 gén által kódolt rAPáz a membránon keresztüli szekréció során glikozilálódik, és a periplazmatikus térben lokalizálódik . A Pho5p felelős az APáz aktivitás >90%-áért .
Mivel a PHO5 géntermék alkotja a savas foszfatázok nagy részét, a PHO5 szabályozása kulcsfontosságú a sejtek foszfát homeosztázisában. A transzkripciós aktivátorok, a Pho4p és a Pho2p szükségesek a PHO5 promóter aktív kromatinszerkezetének létrehozásához és a transzkripció serkentéséhez. A Pho80p-Pho85p egy ciklin/ciklinfüggő kináz komplex, amely több helyen foszforilálja a Pho4p-t, hogy negatívan szabályozza a Pho4p működését . Huang és O’Shea nagy áteresztőképességű, kvantitatív, enzimatikus szűrést végeztek egy élesztő deléciós gyűjteményen, új, a PHO5 expressziójában hibás mutánsokat keresve. A konstitutív mutánsok közül a pho80 és pho85 törzsek mutatták a Pho5 foszfatáz aktivitás és a PHO5 mRNS legemelkedettebb szintjét magas foszfát tartalmú körülmények között, ami összhangban van a PHO útvonalban betöltött központi szerepükkel. A magas kináz aktivitás teljes elvesztése (Pho80p-Pho85) a Pho4 transzkripciós faktor teljes aktiválódását eredményezi, ami teljes PHO5 expresszióhoz vezet.
A foszfatázok másik fontos osztálya az S. cerevisiae-ben az alkáli foszfatázok (ALPáz; optimális pH 8; EC 3.1.3.1). A PHO8 egy nem specifikus, represszálható alkalikus foszfatázt (rALPáz) kódol. Ez egy vákuum-lokalizált glikoprotein, amely különböző szubsztrátokat hasít, hogy visszaszerezze a foszfátot az intracelluláris termékekből . A Pho8p egy Mg2+/Zn2+-függő dimer fehérje, amely hasonló az Escherichia coli és az emlős sejtek ALPázához . A PHO13 enzimterméke monomer fehérje, és specifikus a p-nitrofenilfoszfátra (pNPP) és a hisztidinilfoszfátra. Ez az enzim erősen aktiválódott Mg2+ ionokkal, 8,2 pH optimummal és magas specifikus aktivitással a pNPP-re, 3,6 × 10-5 M átlagértékkel .
4. A foszforstressz modulálja a savas foszfatázokat a növényekben
A savas foszfatázok (APázok) a talajban jelen lévő szerves foszfátok széles skálájával szemben lehetnek aktívak. Ezek az enzimek nem specifikus ortofoszfor monoészter foszfohidrolázok (EC 3.1.3.2), amelyek Pi-t hasítanak le észterkötési helyekről. A szekretált növényi foszfatázok 50%-os aktivitást biztosítanak egy széles pH-tartományban (4,0-7,6), 80%-os aktivitást tartanak fenn egy széles hőmérsékleti tartományban (22°C-48°C), és akár 60°C-os hőmérsékleten is stabilak, így ideális jelöltek az aktív talajenzimek számára.
AzAPázok nagy számban fordulnak elő az Arabidopsisban, és legalább négy géncsalád képviseli őket. Az Arabidopsis annotált genomjának közelmúltbeli áttekintése során 1 His APáz, 4 foszfatid APáz, 10 vegetatív raktározási fehérje APáz és 29 lila APáz szekvenciáját azonosították .
Az utóbbi években jelentős érdeklődés mutatkozott a lila APázok (PAP-ok) iránt. A magasabb növényekből és emlősökből származó PAP-ok szerkezetének összehasonlító elemzése lehetővé tette az ilyen típusú enzimek konzervált szekvenciáinak és szerkezeti motívumainak azonosítását számos eukarióta fajból .
Biokémiai szempontból a növényi PAP-ok homodimer fehérjékként működnek, monomerenként ~55 kDa molekulatömeggel, míg az emlős PAP-ok jellemzően monomer fehérjék, ~35 kDa molekulatömeggel . Sok PAP glikoprotein, amelyek a szekréciós útvonalra irányulnak . A Spirodela oligorrhiza egyik PAP-járól kiderült, hogy glikozil-foszfatidil-inozitol lehorgonyzott a sejtben . Szerkezetileg a növényi PAP-ok két doménnel rendelkeznek. Az NH2-domén nem rendelkezik katalitikus funkcióval. A COOH-domén tartalmazza a fémcentrumot, és az enzim katalitikus doménje. Egy másik, a Lupinus albusból származó PAP tartalmazhat egy harmadik domént, amelynek szerkezete a szterol-deszaturázokéhoz hasonlít, a karboxilvégződésénél . Nem ismert, hogy a poszttranszlációs módosítás utóbbi két formája mennyire gyakori más fajok PAP-jaiban. A PAP-ok olyan metalloenzimek, amelyek aktív helyén egy kétmagos fémion-komplex található. Jellegzetes rózsaszín és lila közötti színük a vasiont koordináló tirozin-maradék általi töltésátadásnak köszönhető. Ez az enzim képes foszforsavészterek és -anhidridek hidrolizálására .
PAP-okat izoláltak Phaseolus vulgaris (közönséges bab) , Glycine max (szójabab) , Lupinus albus (fehér csillagfürt) , Lycopersicon esculentum (paradicsom) , Triticum aestivum (búza) , Hordeum vulgare (árpa) , Zea kukorica (kukorica) és Oryza sativa (rizs) -ból .
A Pi éhezésre adott növényi válasz két kategóriára osztható: a specifikus és az általános válaszra. A specifikus válaszok elősegítik a Pi hatékony mobilizálását és megszerzését a növekedési közegből és az intracelluláris raktárakból. Az általános válaszok lehetővé teszik a hosszú távú túlélést azáltal, hogy a sejtek anyagcseréjét összehangolják a tápanyagok elérhetőségével és a növekedési potenciállal . E stratégiák megvalósítása gének százainak expressziós profiljában bekövetkező változásokat igényel, amint azt az Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) transzkriptom-elemzései mutatják .
Pi éhezés során a növények általános válaszként fokozzák a foszfatázok expresszióját . A foszfatáz termelés a Pi hiányhoz kapcsolódik, és pozitív korrelációt javasoltak a savas foszfatáz termelés és a Pi táplálkozás között . Például az olyan növények, mint a csillagfürt, amelyek hatékonyabban veszik fel a Pi-t a talajból, lényegesen több foszfatázt termelnek a gabonafélékhez képest .
Wu és munkatársai elemezték a fehérjefoszfatázok szabályozását Arabidopsisban, és megállapították, hogy három PAP gént indukál a Pi éhezés . Ezenkívül az At1g25230 gén több mint 2-szeresére indukálódott, ami azt mutatja, hogy ez a gén reagál a Pi éhezésre.
A rizs genomjában összesen 26 feltételezett PAP gént azonosítottak, és a Pi éhezés 10 rizs PAP gén expresszióját indukálta, ami arra utal, hogy ezek fontos szerepet játszanak a rizs alacsony Pi körülményekhez való akklimatizációjában .
A Lycopersicon esculentum (paradicsom) LePS2 génjét indukálja a Pi éhezés . Megjegyzendő, hogy a LePS2 foszfatázok képviselik az első citoplazmatikus foszfatázokat, amelyek a Pi éhezésre adott válasz összetevői . A paradicsomsejtek Pi-éheztetett közegben történő szuszpendálása a PAP-specifikus aktivitás körülbelül 4-szeres növekedéséhez vezetett, de a PAP-specifikus aktivitás alacsony és állandó maradt a magas Pi-tartalmú közegben tartott sejtekben. A PAP-aktivitás növekedése a Pi-éheztetett közegben növekvő sejtekben azt mutatja, hogy a PAP-nak szerepe lehet a Pi elérhetőségének és felhasználásának fokozásában, és kulcsfontosságú lehet az intracelluláris Pi mobilizálásában azáltal, hogy érzékeli a Pi hiányát a paradicsomban .
5. Ektofoszfatázok mint Pi szenzorok
A sejtek plazmamembránja tartalmazhat olyan enzimeket, amelyek aktív helyei nem a citoplazma, hanem a külső közeg felé néznek. Ezeknek az ektoenzimeknek nevezett enzimeknek az aktivitása mérhető intakt sejtek segítségével . Ektofoszfatázokat és ektokinázokat mutattak ki számos mikroorganizmusban, köztük protozoonokban , baktériumokban és gombákban .
Számos tanulmány kimutatta az ektofoszfatázok szerepét a Pi megszerzésében, amelyet a különböző sejttípusok növekedéséhez használnak fel . Gombasejtekben (Fonsecae pedrosoi) a Pi kimerülése a táptalajból nyilvánvalóan különböző ektofoszfatáz aktivitások kifejeződését indukálja . Kimutatták, hogy e gombák exogén Pi hiányában történő termesztése olyan gombasejtek keletkezését eredményezi, amelyek 130-szor nagyobb ektofoszfatáz-aktivitást fejeznek ki, mint a Pi jelenlétében termesztett gombák . A tripanoszomatida sejtek ektofoszfatázokkal rendelkeznek, amelyek a foszfomonoészter-metabolitok hidrolízisével biztosítják a Pi-t . Például a T. rangeli-ben a növekedési közeg alacsony Pi-koncentrációja egy másik ektofoszfatáz aktivitás kifejeződését indukálja, ami arra utal, hogy ez az enzim az extracelluláris közegben jelen lévő foszforilált vegyületek hidrolíziséhez vezet. Ez a hidrolízis hozzájárulhat a Pi megszerzéséhez a T. rangeli epimastigóták fejlődése során.
Pi-limitációs körülmények között a Pseudomona fluoreszcens baktériumok foszfátéhség gének egy sorát expresszálják . Például a P. putida KT2442 törzsben legalább 56 Pi éheztető fehérje indukálódik , a P. fluorescens DF57 törzsben pedig több foszfát éheztető gén indukciójáról számoltak be .
Sok eukariótában a nukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz (E-NPP) fehérjecsalád közvetlenül felelős az extracelluláris nukleotidok foszfát hidrolíziséért. Az NPP1-3 szinte minden emberi szövettípusban megtalálható, és ezek az enzimek egy alkalikus ektonukleotid-pirofoszfatáz/foszfodiészteráz 1-es típusú domént tartalmaznak. S. cerevisiae-ben az NPP1 és NPP2 a Pi-szabályozott transzkripción keresztül szabályozódik fel .
6. Záró megjegyzések
A Pi- olyan vegyület, amely a növekedést korlátozza különböző organizmusokban, amikor a rendelkezésre állása alacsony számos ökoszisztémában . A foszfatáz aktivitás indukciója a Pi éhezés hatására gyakori jelenség a Pi-t a környezetből felvásárló szervezetek körében. Ezek az enzimek képesek foszforilált szubsztrátokat hidrolizálni, hogy a tápanyaghiány idején Pi forrást biztosítsanak. A Saccharomyces cerevisiae-ben a Pi éhezés jelzése legalább négy foszfatáz típus fokozott termelését váltja ki: (1) a savas foszfatázok Pho5, Pho11 és Pho12, amelyek a periplazmatikus térben lokalizálódnak; (2) az alkalikus foszfatáz Pho8, amely a vakuólban lokalizálódik; (3) a glicerin-foszfatáz Hor2; (4) a feltételezett polifoszfatáz Phm5, amely a vakuólban lokalizálódik. Mindezek az enzimek hozzájárulhatnak a szabad Pi megnövekedett szintjéhez. Azonban más funkciók is tulajdoníthatók ezeknek az enzimeknek.
Del Pozo és munkatársai tisztítottak egy savas foszfatázt, az AtACP5-öt, amelyet Pi éhezés indukál Arabidopsis thaliana-ban. Ez az enzim két aktivitást mutat, a foszforilált szubsztrátok hidrolízisét és a peroxidképzést. A foszfatáz aktivitás valószínűleg a Pi-mobilizációban betöltött szerepét tükrözi; a peroxidációs aktivitás arra utal, hogy az AtACP5 a reaktív oxigénfajok metabolizmusában is szerepet játszhat .
A Pi éhezés által indukált foszfatázok együttesen szerepet játszanak a szervezet stresszhez való alkalmazkodásában, bár más szerepeket is találhatunk.
Köszönet
A szerzők köszönik a Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) és Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) által nyújtott pénzügyi támogatást. C. F. Dick és A. L. A. Dos-Santos egyformán hozzájárult ehhez a munkához.