Glükóz, glükóz és glutamin tápanyagforrásokat használtunk, hogy megfejtsük a K562 sejtek szénforgalmát és a BaP kezelés hatására bekövetkező változásokat. Összességében a legnagyobb mennyiségű jelölés beépülését a ribózrészekbe és a laktátba figyeltük meg (a jelölések eloszlásának részleteit lásd és Additional file 1: S1 ábra). Amint az 1. ábrán látható, a glükózból származó jelölés beépülése a Krebs-ciklusba várhatóan a Krebs-ciklus metabolitjainak két, egymástól jelentősen eltérő jelölési mintázatát eredményezi attól függően, hogy a C2 fragmens a piruvát-karboxilázon (PC) vagy a piruvát-dehidrogenázon (PDH) keresztül jut be. A glükózból képződött piruvátból a PDH-n keresztül glutamát, a PC-aktivitáson keresztül viszont glutamát keletkezik. Mivel a PC-aktivitás a piruvátból oxalacetátot állít elő, a PC-ből származó malátra számíthatunk, míg a PDH terméke malát vagy malát lesz.
A glükózból a piruvát-dehidrogenázon (PDH), illetve a piruvát-karboxilázon (PC) keresztül keletkező jeleloszlás. A PDH (piros) esetében a címke beépülését az óramutató járásával megegyező irányban feltételezzük. A PC (kék) esetében a címke beépülését az óramutató járásával ellentétes irányban feltételezzük, kivéve a glutamát óramutató járásával megegyező irányú címkézését. Az α-ketoglutarátból az óramutató járásával megegyező irányú továbbfeldolgozás esetén a C1 elvesztése szukcinátot eredményez, amely a szukcinát szimmetriája miatt azonos a PDH-ból származó termékkel
Az NMR spektrumok azt mutatják, hogy nagy mennyiségű aszpartát és malát PC származék
Amint az ábrán látható. 2. ábrán látható, jelentős különbségek figyelhetők meg a 3 vs. 24 órán keresztül glükózt feldolgozó sejtek között a malát és az aszpartát rezonanciái tekintetében. Ezek a különbségek túlnyomórészt az NMR-kapcsolási állandók változásában nyilvánulnak meg. E csatolási konstansok nagysága a szomszédos szénatom jellegétől függ: egy karbonsavcsoport sokkal nagyobb csatolási állandót eredményez, mint egy CH2 csoport. Az aszpartát vagy malát 13C1 13C2 részének csatolási állandója körülbelül 50-60 Hz, míg a 13C2 13C3 részének csatolási állandója körülbelül 35-40 Hz.
Glükózzal jelölt K562 sejtek HSQC spektrumának metszetei, amelyek a J CC csatolásból eredő csúcsfelosztásokat mutatják. Az aszpartát és a malát HC2 atomjaira vonatkozó spektrumok 3 és 24 órás jelölés esetén láthatók, amelyek különböző méretű látszólagos csatolási állandókat mutatnak
A 2. ábra 24 órás jelölés esetén 53 Hz-es látszólagos csatolási állandókat mutat a malát és az aszpartát C2-je esetében. Ez a nagy látszólagos csatolási állandó azt mutatja, hogy a C2-nek a szomszédos C1-karbonsavcsoporttal való csatolása dominál. Ez a 13C1 13C2 csatolási mintázat (és a 13C3 13C4 is, lásd az 1. kiegészítő fájlt) a PDH-aktivitásból és valószínűleg abból is adódik, hogy a metabolitok hosszabb jelölési időszak esetén többször is áthaladnak a Krebs-cikluson.
A rövid, 3 órás jelölési időszak esetén a C2 esetében kisebb, 47 és 41 Hz-es látszólagos csatolási állandók figyelhetők meg (2. ábra és 1. kiegészítő fájl: S1 ábra), ami arra utal, hogy a szomszédos C3 metiléncsoporttal való csatolás dominál. A 13C2 13C3 rész jelenléte rövidebb jelölési periódusoknál azt mutatja, hogy a PC-aktivitásból származó termék dominál a rövidebb jelölési periódusoknál.
Meg kell jegyezni, hogy a megfigyelt jelfelosztások nem a pontos skaláris csatolási állandókat jelentik a jelölt vegyületek keverékében. Mindazonáltal a megfigyelt változás egyértelműen jelzi a PC-termék nagyobb mennyiségét rövidebb jelölési periódusok esetén mind a malát, mind az aszpartát esetében.
A PC-aktivitás további bizonyítékai az uracil részspektrumaiban
A de novo pirimidinszintézisben az uracil aszpartátból karbamoil-aszpartáton, orotáton és dihidroorotáton keresztül képződik. Ezért az aszpartát jelölési mintázatának tükröződnie kell a pirimidingyűrű jelekben. Kiegészítő fájl 2: Az S2. ábra az uracil várható jelölő beépülését mutatja. Amikor az UDP-ben az uracil bázis aszpartátból szintetizálódik, a 13Cs rendeltetése a következő: Az aszpartát C1-je, C2-je és C3-a az UDP C10-évé, C11-évé és C12-évé válik, míg a C4 elveszik (lásd a 2. kiegészítő fájlt). A HSQC-spektrumokban csak a C11 és a C12 figyelhető meg közvetlenül, mivel a C10-hez nem kapcsolódik proton.
A glükózzal jelölt minták esetében a PC-ból származó aszpartát C2C3-jelölésű lesz. Ez az UDP-ben C11C12 jelzett C11C12 fragmentummá alakul át. A PDH-ból származó aszpartát azonban C1C2 vagy C3C4 jelölésű lehet. Ez az uracilban C10C11, illetve izolált C12-nek felel meg. Ezért a C12 spektrumok a PC vs. PDH aktivitás relatív mennyiségét jelzik; a PC egy doubletet ad a C12-hez, míg a PDH egy singletet ad a C12-nél.
Minden spektrumban mind a singlet, mind a doublet jelek megjelentek a C12-nél (3. ábra). A doublet intenzitása azonban a szinglethez képest háromszorosára változott a 3 és 24 órás adatok között, ami ismét a PC-ről a PDH által közvetített jelölés idővel történő eltolódását jelzi. Több metabolitból az a kép rajzolódik ki, hogy mind a PC, mind a PDH párhuzamos aktivitása fennáll, de a PC termék elsősorban az oxalacetáthoz közvetlenül kapcsolódó termékekbe csatornázódik, ami a PC termék e metabolitokba történő magas megfigyelt mennyiségét eredményezi rövid távú expozíció esetén. Csak hosszabb jelölési idő esetén figyelhető meg a PDH-termék a Krebs-ciklus bal oldali ágában.
A glükózzal jelölt sejtekben az UDP esetében megfigyelt jelek, különböző intenzitásokat (a jelek száma mellett) mutatnak a 3 és 24 órán át jelzett sejtek esetében
BaP-indukált malonát a downstream PC aktivitásból származik K562 sejtekben
Bebizonyítottuk, hogy a malonát oxalacetátból kémiai átalakulással képződhet hidrogén-peroxid hatására, és korábbi tanulmányunkban felvetettük, hogy a BaP kezelés hatására bekövetkező malonát akkumulációt a kezelés által kiváltott, oxalacetátra ható ROS emelkedés hajtja . A mintákat malonáttal spicceltük, hogy megerősítsük a HSQC-spektrumokban a malonát-metilén 1H/13C-rezonanciák hozzárendelését (lásd a 3. és 4. kiegészítő fájlt). Ezt követően ebben a tanulmányban a nyomjelzőkön alapuló megközelítésünk lehetővé tette számunkra, hogy megvizsgáljuk a megfigyelt malonát eredetét.
Amint a 4a. ábrán látható, a ROS-eredetű malonát, amely oxalacetátból származik, és amely közvetlenül piruvátból képződött a PC-aktivitás által glükózzal mint tápanyagforrással, várhatóan a C1 és C2 pozíciókban lenne jelölve. Abban az alternatív helyzetben, amikor a PDH-aktivitás a Krebs-ciklusba való belépéskor a piruvátot acetil-coA-vá alakítja át, a keletkező oxalacetát ROS-közvetítésű átalakulása malonáttá várhatóan két, a C1 vagy a C1 és C2 pozícióban 1:1 arányban jelölt terméket eredményezne, mivel a Krebs-ciklus szimmetrikus szukcináton és fumaráton halad át (lásd még az 1. ábrát).
a Az oxalacetátból dekarboxilezéssel származó malonát várható jelölési mintázata és a közvetlenül megfigyelt 13C spektrumokban várható jelmintázatok. b A malonát HSQC-spektrumának szeletei glükózból származó mintákra BaP-kezeléssel (piros) és anélkül (kék). c A malonát esetében az 1H-13C-HSQC spektrumokban megfigyelt csúcsmintázatok, piros a glükózzal jelölt sejtek esetében, kék a glükózzal jelölt sejtek esetében. d A karbonsavtartomány 13C-NMR spektrumai, amelyeken kék színnel a glükózból származó spektrum látható BaP-vel, piros színnel pedig a nem jelölt malonát referencia spektruma. A centrális csúcs hiánya azt bizonyítja, hogy a 13COO mindig egy jelölt CH2 mellett van. A csillag egy nem malonátból származó szénatomot jelöl
A 4b. ábra a 24 órás BaP-vel kezelt, glükózzal jelölt sejtekből származó HSQC spektrumok egy reprezentatív 1D szeletét mutatja, és egyértelműen bizonyítja a gyógyszer által indukált erős malonát jel keletkezését. A 24 órán keresztül BaP-vel kezelt glükózzal jelölt sejtekből származó megfelelő HSQC-spektrumokban egy 58 Hz-es felosztású, egyértelmű doubletet figyeltünk meg (4c. ábra, piros csúcsok), amely egy karbonsav-szénhez kapcsolt, jelölt CH2-csoportra utal. Ez egyértelműen C1,C2 (vagy C2,C3)-címkézett malonátra utal, amelynek a két karbonsavcsoport közül csak az egyikben van címke. Mindhárom pozícióban jelölt malonát, amely a Krebs-cikluson való többszöri áthaladásból származhat, várhatóan triplettet mutatna a C2-nél a HSQC-spektrum 13C-dimenziójában, mivel legalább néhány százalékban mindkét COO-csoportban jelölt lenne (AX2-kapcsolási minta). Ezért a központi jel hiánya a HSQC-ben erősen jelzi, hogy a malonát az upstream PC-aktivitásból származik. A több Krebs-ciklusból és PDH-aktivitásból származó malonát hiányát az is alátámasztja, hogy a BaP-vel kezelt sejtek 24 órás glükózzal történő jelölése során keletkező malonát csak egy szingletet mutatott (4c. ábra kék csúcsként ábrázolva).
Azért, hogy tovább bizonyítsuk, hogy a gyógyszer által indukált malonát a PC-aktivitás downstream szakaszából származik, 13C-1D-spektrumokat vettünk fel, amelyekben közvetlenül a malonát COO-rezonanciáit tudtuk megfigyelni (4d. ábra). A 10 mM malonsav referencia spektruma ugyanabban a (pH 7) pufferben, mint amit a sejtkivonatokhoz használtunk, megerősítette a COO-rezonancia frekvenciáját (4d. ábra).
A PC által közvetített jelölés várhatóan egy (a malonátból származó) doubletet eredményez a C1-en, míg a PDH által közvetített jelölés várhatóan egy malonátból származó doublet és egy malonátból származó singlet 50:50 arányú keverékét adja (4a. ábra). Bár még 24 órás felvétel után is zajos volt, a levezetett spektrumok egy tiszta, középen maradék jelet nem tartalmazó dublettet mutattak (4d. ábra), ami megerősíti, hogy a PC-eredetű jelölő termék dominál. Ebből arra következtetünk, hogy a malonát valóban a teljes egészében vagy legalábbis túlnyomórészt a PC-aktivitásból származó oxalacetát ROS által közvetített átalakításából származik, és még 24 órás jelölési idő után sem mutat semmilyen hozzájárulást egy esetleges PDH termékből. A glutamint szénforrásként használó kontrollkísérletek csak minimális jelölés beépülését mutatták a malonátba. A glükózból előállított malonát túlnyomórészt PC-n keresztül történő jelölést mutatott. Ez a két tény együttesen erősen arra utal, hogy a malonát túlnyomórészt glükózból keletkezik glikolízisen keresztül és a piruvát PC által közvetített belépése a TCA-ciklusba.
A párhuzamos PDH-aktivitás bizonyítéka
Az 1. táblázat összehasonlítja a 3 és 24 órás címkézett adatsorokban látott 1 J CC csatolási állandókat és a multiplet intenzitásmintázatokat. Mind a 3, mind a 24 órás adatsorokban a glutamát C4-nél történő jelölés sokkal nagyobb, mint a C4-nél történő jelölés, és a C4-nél észlelt hasadás a C5-nél történő csatolást jelzi. Ez határozottan arra utal, hogy a PDH által közvetített jelölés domináns a glutamát esetében mindkét időpontban. A citrát C2-t a C1-hez való nagymértékű kapcsolódás hasítja, ami ismét erősen arra utal, hogy a PDH-mediált jelölés dominál. Ezek a jelölési minták a PDH-termékek egyértelmű dominanciáját jelzik a Krebs-ciklus jobb oldali, a citrátból a glutamátba vezető ágában.
számítógépes multiplet-elemzés
Az 1H-13C-HSQC szeleteket kvantitatívan is elemeztük az NMRLab szoftverben található pyGamma szoftver segítségével a különböző izotópok keverékének 13C-NMR spektrumát szimulálva . A glutamát esetében a multiplet-elemzés megerősítette, hogy a PDH által közvetített jelölés domináns volt mind 3, mind 24 órán keresztül, függetlenül a BaP-kezeléstől. Az aszpartát esetében a multiplet-elemzés megerősítette, hogy a 3 órás PC-mediált jelölésről a 24 órás PDH-mediált jelölés felé történt elmozdulás. A szimulált spektrumok a Additional file 5: S4 ábrán láthatók, a 2. táblázat pedig megerősíti a minőségi eredményeket az aszpartát és a glutamát esetében.
.