A “precíziós” orvoslás megjelenését számos új fejlesztés jellemzi a diagnosztikai, prognosztikai és terápiás módszerek és kezelések terén. E kezdeményezés részeként egyre nagyobb hangsúlyt kap a vizsgálatokhoz szükséges szövetmennyiség minimalizálása a kevésbé invazív és biztonságosabb eljárások révén. Az egyik módszer, amely az utóbbi években jelentős érdeklődést váltott ki, a “folyékony biopszia”. Bár a fogalom pontos jelentését illetően eltérőek a definíciók, nagyjából úgy lehet elképzelni, hogy testfolyadékmintát vesznek a betegkezeléshez szükséges releváns biomarkerek vizsgálata céljából. Leggyakrabban a perifériás vérből történő gyűjtésre alkalmazzák a sejtmentes, keringő tumoros dezoxiribonukleinsavak (DNS) elemzésére.

Az emberi vérben keringő, sejtektől mentes DNS első leírása 1948-ban történt, de ez a szélesebb tudományos közösségben kevés figyelmet keltett2. 1977-ben a tudósok azonosították a sejtmentes DNS (cfDNS) abnormálisan magas szintjét a rákos betegek plazmájában és szérumában az egészséges kontrollbetegekhez képest, és azt feltételezték, hogy ez a cfDNS főként keringő tumor-DNS-t (ctDNS)1,5 jelent. Az eredeti leírás óta más kutatások megállapították, hogy a megnövekedett cfDNS általában számos patológiás folyamatot tükröz, beleértve a rosszindulatú és jóindulatú daganatos betegségeket, gyulladásos betegségeket, stroke-ot, traumát és szepszist. E folyamatok során a nukleinsavak apoptotikus és nekrotikus sejtekből vagy az élő sejtek ellenőrzött szekréciója révén kerülhetnek a vérbe2,11. Bár a sejtmentes DNS-t gyakran a keringő tumor-DNS szinonimájaként használják, nem szabad elfelejteni, hogy a mintában keringő nem tumoros és nem humán DNS is jelen lehet.

Míg jelenleg a DNS dominál, a folyékony biopszia további összetevői közé tartoznak a ribonukleinsavak (RNS), a keringő tumorsejtek (CTC), az extracelluláris vezikulák (EV) és a tumorban képződött trombociták (TEP). Ez utóbbi komponensek főként a kutatási érdeklődés középpontjában állnak. Ahogy egyre több transzlációs kutatást végeznek, a folyékony biopszia ezen további komponensei a jövőben egyre nagyobb klinikai felhasználást nyerhetnek. Ezen elemek áttekintése meghaladja e cikk kereteit, és az olvasót további olvasmányként a Batth et al. cikkére utaljuk.

Technológiai megfontolások

A közelmúltig a rendelkezésre álló technológia nem volt elég érzékeny a ctDNS kimutatásához és értelmes felhasználásához. A vírusok és más mikroorganizmusok nukleinsavainak kimutatására szolgáló, testnedveken végzett molekuláris vizsgálatokkal ellentétben, amelyek viszonylag nagy mennyiségű nukleinsavból profitálnak, a keringő tumoros nukleinsavfragmentumok a normál, nem tumoros cfDNS töredékében vannak jelen. A ctDNS általában 140-170 bázispár (bp)3 közötti kis DNS-fragmentumok, és a tumor típusa, progressziója, terhelése, proliferációs rátája és a terápia mind befolyásolja a mintában lévő ctDNS mennyiségét. Ezenkívül, bár a ctDNS viszonylag stabil a plazmában és a szérumban, a máj és a vese órákon belül eltávolítja a keringésből 3,4. Mindazonáltal a preanalitikus eljárások és tisztítási módszerek fejlődése lehetővé tette a ctDNS sikeres befogását, amplifikálását és szekvenálását.

A jelenleg a ctDNS kimutatására vagy mérésére használt módszerek nagyjából két kategóriába sorolhatók: polimeráz láncreakció (PCR) alapú és újgenerációs szekvenálás (NGS) alapú. A PCR-alapú vizsgálatok általában gyorsabb átfutási idővel rendelkeznek és kevésbé költségesek, de jellemzően egyszerre csak egy vagy néhány specifikus mutációt tudnak értékelni (korlátozott multiplexelési képesség). A PCR-alapú megközelítések tovább oszthatók olyan módszerekre, amelyek a mutáns szekvenciákat a vad típusú (nem mutáns) szekvenciákhoz képest dúsítják, és olyanokra, amelyek a kvantitatív meghatározást kompartmentalizációval érik el. Az utóbbi csoport egyik példája a “digitális PCR”, amelyet egyre szélesebb körben alkalmaznak a ctDNS-ben lévő specifikus, ismert mutációk kimutatására és mennyiségi meghatározására. A PCR-t több ezer apró, egyedi reakciótérfogatra kompartmentálják, akár egy chipen, akár víz az olajban cseppek létrehozásával. Az egyes rekeszek vagy cseppek vagy tartalmazzák a célzott templátfragmentumot, vagy nem, és fluoreszcens jelet adnak, ha a megfelelő templátfragmentum jelen van az adott térfogatban. Az egyes fluoreszcens térfogatok megszámlálásával megbecsülhető a mintában lévő specifikusan célzott templátmolekulák száma. Az egyszerre vizsgált több célpont esetében (multiplexelés) a különböző fluoreszcens jelek specifikus variáns szekvenciákhoz rendelhetők.

A következő generációs szekvenáláson alapuló megközelítések lehetővé teszik a lehetséges mutációk sokkal szélesebb körének értékelését, mivel a szekvenálás a befogott régiókon belül bárhol előforduló mutációkat képes kimutatni. A genom mutációra hajlamos régióinak megcélzása érdekében NGS-könyvtárakat lehet készíteni a plazma DNS-ből akár ligációs/hybrid befogási módszerekkel, akár célzott PCR-dúsítási módszerekkel. A variáns allélfrakciók általában sokkal alacsonyabbak a folyékony biopsziákban, mint a szöveti biopsziákban, gyakran <1%, ezért az érdekes régiókat mélyebben kell szekvenálni, mint a primer tumorszövetek NGS-ében. Ezenkívül a preanalitikus és analitikus folyamatok széles körű optimalizálását kell elvégezni a bemeneti minta maximalizálása és a PCR- és szekvenálási hibák csökkentése érdekében. Az NGS-megközelítések fontos előnye, hogy sokkal szélesebb mutációs lefedettséget tudnak elérni (több ezer lehetséges mutáció egyidejű elemzése). Így nincs szükség a daganat specifikus mutációinak előzetes ismeretére. Az egyszerűbb PCR-alapú módszerekhez képest azonban az NGS-technikák drágábbak, időigényesebbek és technikailag nagyobb kihívást jelentenek.

Előnyök és hátrányok

A folyékony biopsziák előnyei elsősorban abban rejlenek, hogy a standard tumorbiopsziákhoz képest sokkal kevésbé invazív eljárásokkal nyerhetők. Vegyük például egy tüdőtömeg biopsziájának folyamatát. Ha a daganat olyan helyen fekszik, amely intervenciós radiológiai vagy sebészi biopsziával hozzáférhető, fennáll a tüdőtágulat vagy a vérzés kockázata, függetlenül attól, hogy a műtét elvégzéséhez szükséges műtéti lakosztály fenntartása mennyibe kerül. A folyékony biopsziák idővel gyakoribb és sorozatosabb mintavételeket is lehetővé tesznek, hogy nagyobb felbontást adjanak a daganatok viselkedéséről, valamint a terápiára adott válaszukról. Egy vizsgálatban például azoknál a vastagbélrákos betegeknél, akik később radiográfiailag jó választ mutattak a kezelésre, a ctDNS-szintek >90%-kal csökkentek a kezelés első 2 hete után 9 . Ez a gyógyító szándékú reszekciót követő kiújulás kockázatának rétegződését mutatta ki. Egy másik vizsgálatban a rezekciót követően kimutatható ctDNS-t tartalmazó emlőrákos betegeknél 25-ször nagyobb volt a kiújulás kockázata 10. Ezek a koncepciók analógok a jelenleg a hematológiai malignitások, például a krónikus myelogén leukémia (CML) esetében végzett vizsgálatokkal és a BCR-ABL fúziós transzkriptumok jelenlétének sorozatos vizsgálatával. Végül, olyan esetekben, amikor szöveti biopszia nem áll rendelkezésre, a tumorok molekuláris profiljának meghatározása továbbra is elvégezhető folyékony biopszia segítségével.

A folyékony biopszia fontos hátrányai közé tartozik, hogy a kezdeti szövettani diagnózist szöveti biopsziával kell megállapítani. Az ilyen vizsgálatokat végző laboratóriumoknak figyelemmel kell lenniük a tesztek megfelelő felhasználására és a klinikai kontextusban történő “túlértelmezés” lehetőségére. A perifériás véren belüli alacsony variánsfrekvencia magasabb hamis negatív arányokhoz vezethet, és lényegesen nagyobb technikai erőfeszítést és szakértelmet igényel a megbízható eredmények elérése.

A jelenlegi és új alkalmazások

A folyékony biopszia klinikai alkalmazása jelentősen megnőtt 2014 óta, amikor az első kereskedelmi forgalomban kapható multigén folyékony biopszia platform elérhetővé vált. Számos teszt kereskedelmi forgalomban kapható és az FDA által jóváhagyott, és néhányat a biztosítótársaságok elegendőnek tartanak a kezelésre való jogosultsághoz. Például 2016-ban az FDA jóváhagyta a cobas® EGFR Mutation Test v2-t a nem kissejtes tüdőrákos betegek bizonyos EGFR tirozinkináz-gátlókra való jogosultságának meghatározására . A betegek célzott terápiából való kizárására szolgáló folyékony biopszia klinikai elfogadása sokkal lassabb volt, főként a hamis negatív eredményekkel kapcsolatos aggályok és az általában hozzáférhető tumorszövet miatt 3 . A klinikai felhasználás növekedését az is elősegítette, hogy a betegek és az orvosok célzott mutációkat akartak azonosítani off-label alkalmazás vagy klinikai vizsgálatokba való felvétel céljából.

A folyékony biopszia új felhasználási területei közé tartozik a szöveti biopszia mutációs profiljának kiegészítéseként történő felhasználás, a kezelésre adott válasz értékelése, a maradék betegség monitorozása, a betegség kiújulásának kimutatása és a rezisztencia mutációk megjelenésének monitorozása 3 .

Jövőbeli irányok

A mutációk várhatóan rák-specifikus volta a ctDNS-t a rák korai felismerésének vonzó biomarkerévé teszi, ami óriási hatással lehet a betegellátásra. Mivel azonban a korai stádiumú daganatokról ismert, hogy nagyon kevés DNS-t bocsátanak ki, számos technikai kihívást kell leküzdeni. Bár a folyékony biopszia vonzó eszköz lehet a tünetmentes betegek rákszűrésére, az ilyen alkalmazásokat gondosan és átgondoltan kell mérlegelni, hogy elkerüljük a betegek túlzott szenvedését és a hamis pozitív eredmények miatti költségeket. Rövid távon a folyékony biopszia hasznosabb lehet a rosszindulatúság megerősítésére olyan betegeknél, akiknél már klinikailag vagy radiográfiailag látható elváltozások vannak.

Következtetés

A ctDNS-vizsgálatra összpontosító irodalom gyorsan bővül és fejlődik. A folyamatban lévő vizsgálati területek közé tartoznak a preanalitikus folyamatok, a ctDNS kimutatási arányt befolyásoló tényezők és a prospektív klinikai vizsgálatok. A ctDNS-nek a klinikai ellátásban valószínűleg egyre nagyobb szerepet fogunk játszani, mivel a CTC-k, a cfDNS/RNS és az extracelluláris vezikulák folyamatos kutatása nagyobb felbontást fog biztosítani a folyékony biopsziával nyert tumorstátusz pillanatfelvételéhez.4.