Fungos tipo chaetomium causando infecções oportunistas em humanos: um possível papel da extremotolerância

Identificação de moldes filamentosos no laboratório clínico de rotina ainda se baseia principalmente no exame microscópico de colônias esporulantes. Fungos sem esporocarpsos ou esporos característicos são difíceis de identificar (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). No presente estudo, foram analisadas 13 cepas estéreis ou não-diagnósticas. Com base nas características fenotípicas os isolados foram identificados como espécies Papulaspora devido à formação de tufos ou estruturas semelhantes a bulbos (Vinod Mootha et al. 2012). Com tentativas de induzir esporulação usando vários substratos e condições de incubação, algumas cepas produziram conidias minúsculas em piálidos curtos, mas ainda assim estas conidias não foram diagnosticamente úteis e não puderam ser usadas para identificação de espécies.

Com análise molecular e filogenética de seis loci, as cepas foram encontradas como pertencendo a três novas espécies que são descritas no presente estudo. Duas espécies agrupadas com o tipo de espécie do gênero Subramaniula, enquanto uma era irmã de duas espécies de Chaetomium descritas. Tanto Subramaniula como Chaetomium são membros da família Chaetomiaceae (Sordariales). Os membros desta família são caracterizados pela formação de ascósporos em asci deliquescentes dentro de peritécios mais ou menos extensamente ornamentados (Whiteside 1961). A identificação fenotípica das espécies em Chaetomiaceae depende principalmente da forma dos pêlos ascomatais, pigmentação e ornamentação ascoma e forma ascospore (Ames 1961; von Arx et al. 1984). As três espécies descritas no presente estudo exibiram características morfológicas incomuns por não formarem reprodução sexual nos ascomatosos. Ao invés disso, aglomerados de células pigmentadas de paredes espessas e escuras estavam presentes. Não está claro se estas estruturas representavam peritécias imaturas (Davey et al. 2008). No quadro da nomenclatura singular para fungos (Taylor 2011), as espécies estão aqui descritas em gêneros sexuais com base na sua posição filogenética dentro da Chaetomiaceae.

As duas novas espécies agrupadas com Subramaniula tiveram origem em fontes clínicas, principalmente infecções oculares ou cutâneas. O gênero Coprophilous Subramaniula é atualmente conhecido de duas espécies que foram transferidas de Achaetomium, ou seja, S. irregularis e a espécie genérica tipo S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). O gênero Subramaniula é caracterizado por ascomata pálida glabra com amplas aberturas apicais (Fig. 8), sem uma morfologia assexuada conhecida. Cannon (1986) relatou “Algumas hifas com cadeias de células consideravelmente inchadas, produzindo corpos globosos de paredes finas ou elipsoidais para 8 μm diam, mas pode muito bem não funcionar como propagação”. Alguns autores sugeriram que esses corpos podem estar relacionados ao estado assexual desse fungo (Pastirčák e Pastirčáková 2009). Ao examinarmos a estirpe do extipo de S. thielavioides (CBS 122,78), detectamos cadeias de células inchadas, mas não foram vistos corpos de paredes finas. Em comparação com nossas duas novas espécies Subramaniula nas quais foram observadas conidias, estas estruturas são improváveis de serem as conidias, mas podem atuar como propagadores de sobrevivência. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) é descrita como morfologicamente semelhante a S. thielavioides com algumas diferenças na forma e tamanho dos ascósporos e pigmentação dos ascomatos, mas não existe cultura viva para esta espécie (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides foi isolada de uma amostra de estrume da Índia, enquanto S. irregularis só é conhecido do solo na África do Sul (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Até agora, nenhuma infecção humana foi atribuída à Subramaniula. No entanto, Cannon (1986) relatou o isolamento de S. thielavioides de uma unha humana e, curiosamente, ele relatou “Micólogos médicos devem estar cientes de sua existência”. Com as duas espécies clínicas recentemente descritas, o gênero Subramaniula é confirmado como tendo potencial como um gênero oportunista, eventualmente causando infecções de pele, olhos e unhas. Uma cepa não identificada de uma úlcera corneana publicada por Vinod Mootha et al. (2012), CBS 123294, é descrita no presente estudo como uma nova espécie de asteróides Subramaniula. A cepa foi recuperada de um paciente que usava lentes de contato e que foi ferido com um fio enquanto trabalhava em um estábulo para cavalos. A cepa dH 21571 dizia respeito a uma ceratite surgida após um trauma ocular com uma folha afiada de planta em um campo agrícola na Índia tropical. Duas outras cepas dos EUA também foram derivadas de úlceras da córnea. Duas outras cepas de infecções oculares na Espanha combinaram com asteróides S.; o CNM-CM 4314 foi isolado do exsudato corneal de um paciente de 27 anos de idade, CNM-CM 7482 originou-se de uma endoftalmite de um paciente imunossuprimido de 47 anos de idade; foram observadas hifilas no humor vítreo e o paciente perdeu o olho. Assim, os asteróides subramaniula parecem ter uma forte associação com infecções oculares traumáticas. No decorrer deste estudo, outra sequência derivada de um isolado (UTHSC 03-1315) de pele de um paciente da Arábia Saudita também foi identificada como asteróides S. O único isolado ambiental de asteróides de S. também teve origem na Arábia Saudita, nomeadamente em solo arenoso do deserto sob impacto de hidrocarbonetos. Foi recuperado por enriquecimento de tolueno (Zhao et al. 2010), um método concebido para o isolamento de fungos que crescem sob condições tóxicas.

Subramaniula obscura é descrito no presente trabalho para uma única estirpe de um macho kuwaitiano de 53 anos presente com uma infecção do dedo do pé. A estirpe foi inicialmente identificada como Chaetomium cuniculorum. Verificamos que as cepas de C. cuniculorum estão filogenicamente relacionadas com S. obscura, já que ambas foram encontradas em um único clade suportado baseado na análise do gene ribossômico (ML-BS/PP, 84%/1,0) e na análise multilocus dos genes codificadores de proteínas (ML-BS/PP, 100%/0,99) (Fig. 2). Com o sequenciamento ITS e usando um número limitado de taxa, a separação das duas espécies pode de fato ser difícil. A sequência ITS da estirpe ex-tipo de S. obscura, CBS 132916, mostrou 97 % de similaridade com os isolados de C. cuniculorum. Pensa-se que esta última espécie ocorre principalmente no esterco e cerca de metade das estirpes de C. cuniculorum mantidas na coleção de cultura de CBS originou-se do esterco de animais herbívoros. A sua semelhança de S. obscura com S. thielavioides é de 99,4%, mas os genes codificadores de proteínas são consistentemente diferentes e portanto a descrição da nova espécie em Subramaniula é justificada.

A macro e micro-morfologia de Subramaniula obscura é similar à de S. asteroides, exceto pelo fato das células que formam os tufos de S. obscura serem mais acastanhadas e arredondadas, e as hifas serem mais espessas e com protuberâncias semelhantes a verrugas. A temperatura mínima de crescimento para ambas as espécies e para S. thielavioides é de 6 °C, e todas elas cresceram muito bem acima dos 40 °C, o que indica a termotolerância das espécies Subramaniula. O crescimento ótimo foi entre 33 e 36 °C, e a sobrevivência consistente a 37 °C denota a capacidade de crescer à temperatura do corpo humano como fator de virulência (Revankar e Sutton 2010).

Identificação da cepa Chaetomium anamorphosum CBS 137114 como uma espécie nova, recuperada da peritonite humana, foi inicialmente feita por comparação morfológica com espécies Papulaspora descritas. Esta cepa mostrou alguma semelhança com Papulaspora nishigaharanas pela formação de agregados de células de parede espessa de cor marrom, assim como pela produção de pialoconidia (Watanabe 1991). A comparação de sequências de ITS e da região D1/D2 do gene rRNA 28S no GenBank não revelou homologia com nenhuma espécie sequenciada conhecida. Com a abordagem filogenética molecular conseguimos resolver a taxonomia deste isolado como parente próximo das espécies ascosporulantes Chaetomium irregulare e C. fusisporum (Figs. 1, 2, e 9). As novas espécies identificadas diferem do C. irregulare e do C. fusisporum, não só na morfologia mas também na temperatura de crescimento. A temperatura ótima de crescimento de C. anamorphosum foi de 33-36 °C e o crescimento ainda foi observado a 40 °C, enquanto que para C. irregulare a ótima foi de 30 °C e não foi capaz de crescer ou cresceu apenas mal a 40 °C. Chaetomium irregulare foi transferido para o gênero Achaetomium por Rodríguez et al. (2004). Entretanto, quando comparado com o tipo genérico Achaetomium globosum, foi encontrado distante e o nome Achaetomium irregulare é redundante. A taxonomia e nomenclatura do clade contendo as novas espécies e outras Chaetomium spp. como parafilético a Subramaniula não são claras devido à distância relativamente grande à espécie genérica do tipo C. globosum. Além disso, a morfologia dos ascomata, dos pêlos ascomatais, se presentes, e dos ascósporos das espécies deste clade é diferente da do C. globosum. Os gêneros Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula e Achaetomiella foram morfologicamente semelhantes com poucas diferenças na presença e ausência de pêlos ascomatais, parede ascoma, cor ascospore e na taxa de crescimento (Cannon 1986). Estes caracteres tornaram-se em grande parte irrelevantes devido à disponibilidade de dados moleculares. Enquanto se aguarda uma revisão taxonômica do Chaetomium, mantemos a classificação atual do agrupamento dentro deste gênero, reconhecendo Subramaniula como um gênero aninhado dentro do Chaetomium.

Apesar do grande número de espécies descritas em Chaetomium e parentes, pouco se sabe sobre a sua taxonomia molecular e apenas algumas espécies foram sequenciadas e estão disponíveis em bases de dados públicas (Wang et al. 2014). A maioria dos estudos anteriores foi restrita a espécies raras, e a filogenia de espécies mais ubíquas de Chaetomium continua por resolver (Asgari e Zare 2011; Lee e Hanlin 1999; Wang et al. 2014). Recentemente, três novas espécies no grupo C. indicum foram descritas com base na análise molecular de quatro genes (Wang et al. 2014). Outro estudo molecular de Chaetomium foi o de Asgari e Zare (2011) no Irão, usando a análise filogenética de três genes, resultando na delimitação de seis novas espécies. Dois destes mostraram morfologias assexuadas semelhantes às formadas pelo Chaetomium anamorphosum e por ambas as espécies Subramaniula descritas no presente trabalho. Chaetomium rectangulare Asgari e Zare (2011) pertencem ao grupo C. globosum caracterizado por morfologias assexuadas com pialides e conidia muito semelhantes às das nossas novas espécies. Isto pode indicar que a nova espécie perdeu de alguma forma a sua capacidade de formar a frutificação sexual e substituiu-a por um tipo de esporulação assexuada. A sequência do locus MAT que regula a reprodução sexual pode indicar se as morfologias sexuais nestas espécies estão ausentes ou suprimidas.

Sorume animal, matéria vegetal em decomposição e solo são habitats naturais conhecidos para as espécies Chaetomium, Subramaniula e Papulaspora. De Hoog et al. (2013b) notaram que o gênero Madurella está aninhado dentro do Chaetomium e que muitas espécies no Chaetomiaceae combinam a associação de dung-association com condições climáticas áridas. Acrescentando ao Chaetomium as espécies não-ascosportivas anteriormente não identificadas, o papel deste género na doença humana e animal aumentou significativamente. Infecções por Chaetomium e infecções por espécies agrupadas na árvore filogenética Chaetomium, como Chaetomidium e Thielavia, foram relatadas por pele, pêlos e unhas (Hubka et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Além disso, várias espécies de Chaetomiaceae têm sido relatadas para causar infecções oportunistas graves em pacientes imunocomprometidos (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Vários casos de peritonite semelhantes aos nossos em C. anamorphosum foram relatados em indivíduos imunocomprometidos que tinham adquirido a infecção durante a diálise peritoneal. Febré et al. (1999) isolaram C. globosum de frascos de líquido de diálise; a peritonite foi relatada por Baer et al. (2013). Um caso interessante publicado por Issa et al. (2013) dizia respeito a uma peritonite em uma fêmea imunocompetente de Damam, Arábia Saudita, causada por uma espécie desconhecida de Chaetomium. Aparentemente também os indivíduos imunocompetentes estão em risco de infecções profundas por Chaetomium ou fungos relacionados. Como exemplo, um caso de feofomicose cerebral fatal causada por Thielavia subthermophila foi relatado em indivíduos imunocompetentes (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum e C. strumarium eram agora considerados como espécies neurotrópicas causadoras de infecções graves e potencialmente fatais (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Parece que os membros da Chaetomiaceae têm de facto um potencial clínico subestimado, sendo urgentemente necessária uma reavaliação do papel do género na patologia humana. O habitat natural de muitas espécies em climas áridos e a sua sobrevivência a altas temperaturas provavelmente aumentam a sua sobrevivência no tecido mamífero. A capacidade do C. anamorphosum de crescer de forma óptima a 36 °C, em contraste com o C. irregulare, é um bom exemplo. As espécies são capazes de quebrar a zona de exclusão térmica do corpo humano e se houver imunossupressão ou outros fungos com problemas imunológicos podem surgir como potenciais patógenos humanos (Casadevall 2012).

De acordo com os critérios fenotípicos, alguns casos mais antigos de espécies Chaetomium ou Subramaniula podem ter sido erroneamente desconsiderados ou relatados como casos de infecção por Madurella ou Papulaspora (Mohd-Tahir et al. 2012). Nossos estudos mostram claramente que infecções traumáticas e oportunistas por espécies do tipo Chaetomium muitas vezes produzem cepas não ou com pouco espessor em cultura (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). A descrição destas estirpes como entidades taxonómicas separadas no género é significativa, tanto do ponto de vista clínico como epidemiológico. Além disso, os estudos de susceptibilidade antifúngica são escassos e os protocolos de tratamento são urgentemente necessários.

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