Abstract

Babstromet metabolismo celular depende da concentração apropriada de fosfato inorgânico intracelular (Pi). Genes Pi responsivos à fome parecem estar envolvidos em múltiplas vias metabólicas, implicando um complexo sistema de regulação Pi em microrganismos e plantas. Um grupo de enzimas é necessário para a absorção e manutenção de níveis adequados de fosfato, que é liberado por ésteres fosfatados e anidridos. O sistema de fosfatase é particularmente adequado para o estudo de mecanismos reguladores, pois a atividade da fosfatase é facilmente medida usando métodos específicos e a diferença entre os níveis reprimidos e os níveis de atividade da fosfatase reprimidos é facilmente detectada. Este artigo analisa o sistema de fosfatase protéica induzida durante a inanição de fosfato em diferentes organismos.

1. Introdução

Regulação dos processos celulares, tais como diferenciação celular, proliferação, morte celular, mobilidade, metabolismo, sobrevivência e organização do citoesqueleto, em resposta a alguns estímulos é fundamental para todos os aspectos da vida celular . A fosforilação proteica é um dos mecanismos mais comuns utilizados para regular estes processos. Os processos que são reversivelmente controlados pela fosforilação proteica requerem tanto uma proteína cinase como uma proteína fosfatase.

Tradicionalmente, a proteína quinase tem sido estudada mais intensamente do que a proteína fosfatase devido à visão anterior de que a proteína quinase confere regulação fina à fosforilação protéica, enquanto a proteína fosfatase atua apenas para remover grupos fosfatados. Somente na última década foi percebido que as fosfatases protéicas também são reguladas por uma variedade de mecanismos e não são de menor importância para a fisiologia celular do que as cinases protéicas. As fosfatases proteicas são capazes de hidrolisar metabólitos fosfomonoester, liberando fosfato inorgânico (Pi) destes substratos .

Phosphorus, na forma de fosfato inorgânico (Pi), é um dos macronutrientes mais importantes para todos os organismos . Não só é usado na biossíntese de componentes celulares, tais como ATP, ácidos nucleicos, fosfolípidos e proteínas, mas também está envolvido em muitas vias metabólicas, incluindo transferência de energia, ativação de proteínas e processos metabólicos de carbono e aminoácidos . Grandes quantidades de fosfato são necessárias para a sobrevivência das células. Nas plantas, o Pi é essencial para o crescimento e desenvolvimento . Em fungos, a via de transdução de sinal Pi regula a expressão de muitos genes que respondem ao fosfato e que estão envolvidos na absorção de fontes extracelulares. Nos parasitas tripanossomatídeos, Pi influencia sua capacidade de crescimento e colonização correta no hospedeiro invertebrado .

Em resumo, as fosfatases protéicas e as kinases são necessárias para a homeostase de Pi durante a aquisição, armazenamento, liberação e integração metabólica de Pi . O objetivo deste trabalho é resumir a regulação das fosfatases por fosfato inorgânico, com ênfase no papel dessas enzimas na biologia celular.

2. Controle de feedback das fosfatases por fosfato inorgânico: A via PHO

Saccharomyces cerevisiae tem várias fosfatases com diferentes especificidades, localização celular, e permeases usadas na captação de Pi. O conjunto de genes responsáveis por estas atividades são coordenadamente reprimidos pela concentração de Pi no meio de crescimento. A aquisição, armazenamento, liberação e integração metabólica das células de Pi requer a participação de muitas enzimas essenciais como as fosfatases ácidas extracelulares (APases), fosfodiesterases, transportadores de Pi, polifosfato de quinases, fosfatases alcalinas (ALPases) e endopolifosfatases. As atividades dessas enzimas estão intrinsecamente ligadas à homeostase Pi, e são submetidas à regulação através da via de transdução do sinal Pi (PHO) em resposta a níveis variáveis de Pi .

Em um modelo atual de regulação PHO, o regulador positivo (ou fator positivo) Pho4p, codificado pelo gene PH04, é indispensável para a ativação transcripcional dos genes PHO por sua atividade e localização. Em meio Pi alto, um complexo de cinase dependente de ciclina (CDK) consistindo de Pho80p e Pho85p inibe a função da Pho4p por hiperfosforilação. A Pho4p hiperfosforilada permanece no citoplasma e é incapaz de ativar a transcrição dos genes PHO . Quando a concentração de Pi no meio é suficientemente baixa, a Pho81p inibe a função do complexo Pho80p-Pho85p , permitindo que a Pho4p se transfira para o núcleo e ative a transcrição dos genes da PHO . Estes genes codificam para os transportadores de alta afinidade Pho84p e Pho89p; fosfatases ácidas secretadas Pho5p, Pho11p e Pho12p; outras proteínas relacionadas que aumentam a recuperação de Pi de fontes extracelulares .

Esta via PHO tem sido descrita em diferentes organismos como plantas, bactérias e fungos .

3. O Sistema Fosfátase em Levedura

Inicialmente, foi observado que vários genes da fosfatase são modulados pela concentração de Pi no meio de cultura; assim, a via da FOP foi inicialmente caracterizada por fosfatases diferentemente expressas .

Em S. cerevisiae, a transcrição dos genes que codificam ácido e fosfatases alcalinas e o transportador de Pi é coordenadamente reprimido e desprendido dependendo da concentração de Pi no meio de cultura . A maioria das fosfatases sintetizadas sob condições limitantes de Pi estão localizadas extracelularmente ou associadas à membrana plasmática ou parede celular .

Os genes da fosfatase Pi-regulada incluem PHO5 , que codifica a maior parte das fosfatases ácidas repressíveis (rAPase; pH ótimo 3-4; EC 3.1.3.2), e suas isozimas PHO10 e PHO11 . Estas três rAPases são glicoproteínas que se encontram na parede celular ou no espaço periplásmico. Elas são responsáveis pelo fosfato e trabalham em conjunto com os transportadores de alta afinidade para adquirir fosfato quando a concentração de Pi no ambiente é baixa. A rAPase codificada pelo gene PHO5 é glicosilada durante a secreção através da membrana e é localizada no espaço periplásmico . A Pho5p é responsável por >90% da atividade da APase .

Porque o produto do gene PHO5 constitui a maior parte das fosfatases ácidas, a regulação da PHO5 é fundamental para a homeostase do fosfato celular. Os ativadores transcripcionais, Pho4p e Pho2p, são necessários para gerar a estrutura ativa da cromatina no promotor PHO5 e estimular a transcrição. Pho80p-Pho85p é um complexo de ciclina/ciclina quinase dependente de fósforo Pho4p em vários locais para regular negativamente a função Pho4p . Huang e O’Shea realizaram uma tela de alto rendimento, quantitativa e enzimática de uma coleção de eliminação de leveduras, buscando novos mutantes defeituosos na expressão da PHO5. Entre os mutantes constituintes, as cepas pho80 e pho85 mostraram os níveis mais elevados de atividade da fosfatase Pho5 e mRNA PHO5 sob condições de alta fosfatase, consistentes com seu papel central no caminho da PHO. A perda completa da alta atividade cinase (Pho80p-Pho85) resulta na ativação completa do fator de transcrição da Pho4, levando à expressão completa da PHO5.

Outra classe importante de fosfatases em S. cerevisiae são as fosfatases alcalinas (ALPase; pH ótimo 8; EC 3.1.3.1). Codificação PHO8 para uma fosfatase alcalina repressiva não específica (rALPase). É uma glicoproteína localizada a vacuole que cliva diversos substratos para recuperar fosfato de produtos intracelulares. A Pho8p é uma proteína dimérica dependente de Mg2+/Zn2+, semelhante à ALPase em Escherichia coli e em células de mamíferos . O produto enzimático da PHO13 é uma proteína monomérica e é específico para o p-nitrofenil fosfato (pNPP) e histidinil fosfato. Esta enzima foi fortemente ativada por íons Mg2+, com pH ótimo de 8,2 e alta atividade específica para pNPP, com valor médio de 3,6 × 10-5 M .

4. Fosfatases Ácidas Fosfatases de Fósforo Moduladas em Plantas

Fosfatases Ácidas (APases) podem ser ativas contra uma ampla gama de fosfatos orgânicos presentes no solo. Estas enzimas são fosfatases monoesteroidrofóricas não específicas (EC 3.1.3.2) que clivam Pi de sítios de ligação de ésteres. As fosfatases vegetais secretas sustentam 50% de atividade sobre uma ampla faixa de pH (4,0-7,6), mantêm 80% de atividade sobre uma ampla faixa de temperatura (22°C-48°C), e são estáveis a temperaturas tão altas quanto 60°C, tornando-as candidatas ideais para as enzimas ativas do solo.

APases são abundantes em Arabidopsis e são representados por pelo menos quatro famílias de genes. Um levantamento recente do genoma arábidopsis anotado identificou seqüências para 1 Sua APase, 4 APases fosfatídicas, 10 APases de armazenamento vegetativo, e 29 APases púrpuras .

Nos últimos anos, tem havido um interesse considerável em APases púrpuras (PAPs). A análise comparativa da estrutura das PAPs de plantas e mamíferos superiores tem permitido a identificação da sequência conservada e motivos estruturais neste tipo de enzima de muitas espécies eucarióticas.

Biochemicamente, as PAPs vegetais funcionam como proteínas homodiméricas com uma massa molecular de ~55 kDa por monómero, enquanto que as PAPs de mamíferos são tipicamente proteínas monoméricas com uma massa molecular de ~35 kDa . Muitos PAPs são glicoproteínas que são alvo do caminho de secretariado . Um PAP da Spirodela oligorrhiza foi descoberto como sendo glicosilfosfatidilinositol ancorado na célula . Estruturalmente, os PAPs vegetais têm dois domínios. O domínio NH2 não tem função catalítica. O domínio COOH tem o centro metálico e é o domínio catalítico da enzima. Outro PAP de Lupinus albus pode conter um terceiro domínio, com uma estrutura parecida com a de desaturases de esterol, em seu terminal carboxil . Não se sabe quão comuns são as duas últimas formas de modificação pós-traducional nos PAPs de outras espécies. Os PAPs são metalloenzimas que possuem um complexo binuclear de íons metálicos em seu sítio ativo. Sua cor característica rosa a roxo é devido a uma transição de transferência de carga por um resíduo de tirosina coordenando um íon férrico . Esta enzima pode hidrolisar ésteres de ácido fosfórico e anidridos .

PAPs foram isolados de Phaseolus vulgaris (feijão comum) , Glycine max (soja) , Lupinus albus (tremoço branco) , Lycopersicon esculentum (tomate) , Triticum aestivum (trigo) , Hordeum vulgare (cevada) , Zea maize (milho) , e Oryza sativa (arroz) .

A resposta da planta à fome Pi pode ser dividida em duas categorias: a resposta específica e a resposta geral. As respostas específicas promovem a mobilização e aquisição eficiente de Pi de lojas de crescimento médio e intracelulares. As respostas gerais permitem a sobrevivência a longo prazo através da coordenação do metabolismo celular com a disponibilidade de nutrientes e o potencial de crescimento. A implementação destas estratégias requer mudanças nos perfis de expressão de centenas de genes, como demonstrado pelas análises do transcriptoma de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

Durante a fome Pi, as plantas melhoram a expressão da fosfatase como uma resposta geral . A produção de fosfatase está ligada à deficiência de Pi, tendo sido proposta uma correlação positiva entre a produção de fosfatase ácida e a nutrição de Pi . Por exemplo, plantas como o tremoço, que são mais eficientes na aquisição de Pi do solo, produzem significativamente mais fosfátase em comparação com os cereais .

Wu et al. analisaram a regulação de fosfatases proteicas na Arabidopsis e descobriram que três genes para PAP foram induzidos pela inanição de Pi. Além disso, o gene At1g25230 foi induzido mais de duas vezes, mostrando que este gene é responsivo à inanição de Pi.

No genoma do arroz, um total de 26 supostos genes PAP foram identificados, e a inanição de Pi induziu a expressão de 10 genes PAP do arroz, sugerindo que estes desempenham papéis importantes na aclimatação do arroz a condições baixas de Pi .

Em Lycopersicon esculentum (tomate), LePS2, é induzido pela inanição de Pi . Note-se que as fosfatases de LePS2 representam as primeiras fosfatases citoplasmáticas que são componentes da resposta à inanição de Pi . A suspensão das células do tomate em meio Pi-starved levou a um aumento da actividade específica de PAP de aproximadamente 4 vezes, mas a actividade específica de PAP permaneceu baixa e constante nas células mantidas em meio Pi alto. O aumento da actividade de PAP no crescimento celular em meio Pi-starved demonstra que PAP poderia ter um papel no aumento da disponibilidade e utilização de Pi e pode ser fundamental para a mobilização intracelular de Pi ao detectar uma falta de Pi no tomate .

5. Ectofosfátases como Sensores de Pi

A membrana plasmática das células pode conter enzimas cujos locais activos enfrentam o meio externo e não o citoplasma. As actividades destas enzimas, referidas como ectoenzimas, podem ser medidas utilizando células intactas . As ectofosfatases e ectokinases foram detectadas em vários microorganismos, incluindo protozoários, bactérias e fungos.

Muitos estudos têm demonstrado um papel das ectofosfatases na aquisição de Pi para uso no crescimento de vários tipos de células . Nas células fúngicas (Fonsecae pedrosoi), o esgotamento de Pi do meio de cultura induz aparentemente a expressão de diferentes actividades ectofosfátase . O cultivo destes fungos na ausência de Pi exógeno tem demonstrado resultar na geração de células fúngicas expressando uma atividade ectofosfátase 130 vezes maior do que aquela expressa por fungos cultivados na presença de Pi . As células tripanossomáticas têm ectofosfátases que fornecem Pi através da hidrolização dos metabólitos fosfomonoester . Por exemplo, em T. rangeli, uma baixa concentração de Pi no meio de crescimento induz a expressão de uma atividade ectofosfatase diferente , sugerindo que esta enzima leva à hidrolização de compostos fosforilados presentes no meio extracelular. Esta hidrólise poderia contribuir para a aquisição de Pi durante o desenvolvimento de T. rangeli epimastigotes .

Em condições de limitação de Pi, as bactérias fluorescentes Pseudomona expressam um conjunto de genes de inanição de fosfato . Por exemplo, pelo menos 56 proteínas de inanição de Pi são induzidas na cepa P. putida KT2442 , e, na cepa P. fluorescens DF57, foi relatada indução de vários genes de inanição de fosfato .

Em muitas eucariotas, a família de proteínas nucleotídicas pirofosfátase/fosfodiesterase (E-NPP) é diretamente responsável pela hidrólise de fosfato de nucleotídeos extracelulares. NPP1 a -3 são encontradas em quase todos os tipos de tecidos humanos, e estas enzimas contêm um domínio de pirofosfatase/phosphodiesterase tipo 1 de ectonucleotídeo alcalino. Em S. cerevisiae, NPP1 e NPP2 são upreguladas via transcrição Pi-regulada .

6. Observações Conclusivas

Pi é um composto que é limitador de crescimento em vários organismos quando a sua disponibilidade é baixa em muitos ecossistemas . A indução da atividade da fosfatase em resposta à fome Pi é um fenômeno comum entre os organismos que adquirem Pi do meio ambiente. Estas enzimas são capazes de hidrolisar substratos fosforados para fornecer uma fonte de Pi durante uma escassez de nutrientes. Em Saccharomyces cerevisiae, o sinal de inanição de Pi provoca o aumento da produção de pelo menos quatro tipos de fosfátases: (1) as fosfatases ácidas Pho5, Pho11 e Pho12, que estão localizadas no espaço periplasmático; (2) a fosfatase alcalina Pho8, que está localizada no vacúolo; (3) a glicerol fosfatase Hor2; (4) a suposta polifosfatase Phm5, que está localizada no vacúolo. Todas estas enzimas podem contribuir para o aumento dos níveis de Pi livre. Entretanto, outras funções poderiam ser atribuídas a estas enzimas.

Del Pozo et al. purificaram uma fosfatase ácida, AtACP5, que é induzida pela fome de Pi em Arabidopsis thaliana. Esta enzima apresenta duas atividades, hidrólise de substratos fosforados e formação de peróxidos. A atividade da fosfatase provavelmente reflete um papel na mobilização de Pi; a atividade de peroxidação sugere que AtACP5 também poderia desempenhar um papel no metabolismo de espécies reativas de oxigênio .

Fosfatases induzidas pela inanição de Pi em conjunto desempenham um papel na adaptação de um organismo ao estresse, embora outros papéis possam ser encontrados.

Avalores

Os autores reconhecem o apoio financeiro dado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick e A. L. A. Dos-Santos contribuíram igualmente para este trabalho.