Fevereiro 15, 2010 (Vol. 30, No. 4)
Scott B. Mohler
Passos simples para uma bioluminescência bem sucedida
Luciferina é o substrato básico dos ensaios de bioluminescência. Baseado numa reacção simples onde o ATP alimenta a catálise luciferase da luciferina do escaravelho para produzir luz, a bioluminescência tem amplas aplicações. O seu emprego como indicador de biomassa permite a detecção de microrganismos em produtos de consumo, superfícies de fábricas e até tem sido utilizado para determinar se existe vida na lua e em Marte.
Bioluminescência está a ser utilizada na monitorização in vitro e in vivo de processos biológicos incluindo a expressão genética e as interacções proteína-proteína. A luciferina é usada, por exemplo, em ensaios de genes repórteres para estudar a regulação e função gênica, onde a expressão da luciferina é um marcador para indicar a absorção bem sucedida do gene de interesse em técnicas de DNA recombinante. Como reagente de detecção, a reação luciferina-luciferase é utilizada em pirosequenciamento para realizar a detecção rápida de bases nos atuais sistemas de seqüenciamento de DNA de alto rendimento.
Mais recentemente, a bioluminescência surgiu como uma técnica poderosa para o estudo direto de diferentes populações de células em pequenos animais vivos, como ratos. Nesta técnica, as células (por exemplo, células cancerígenas, células-tronco, células T) são projetadas para expressar luciferase e iluminar. A visualização não invasiva em animais vivos utilizando uma câmera sensível de dispositivo de acoplamento de carga torna assim possível a observação em tempo real da progressão e regressão da doença em diferentes momentos ao longo do tratamento terapêutico. Empregada para compreender a base molecular de patologias como doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, obesidade e câncer, esta técnica é de imenso valor para o desenvolvimento clínico, diagnóstico e medicamentoso.
Os cientistas da Regis Technologies identificaram pontos fracos comuns nos ensaios de luciferase. Os problemas ocorrem frequentemente antes do início do ensaio. A luciferina Firefly é uma molécula sensível e mesmo experiências bem planeadas podem dar resultados errados se a luciferina for mal manuseada e danificada antes de ser usada. Neste artigo, descrevemos o sal, pureza, manuseio e armazenamento ideais da luciferina para garantir resultados consistentes e bem sucedidos em imagens de animais e outros ensaios.
Considerações de compra
Pesquisadores frequentemente se perguntam qual a forma de luciferina a ser usada. Os sais de potássio e sódio da luciferina são normalmente utilizados de forma intercambiável. Entretanto, a dissolução da molécula é um fator importante a ser considerado em alguns ensaios. O sal de sódio é mais solúvel em água (>100 mg/mL) do que o sal potássico (55 mg/mL). A forma de ácido livre, embora ainda disponível, não é frequentemente utilizada devido à sua dificuldade de dissolução.
Porque algumas impurezas podem impactar experiências de diferentes maneiras, a pureza inicial do reagente pode ser uma consideração importante.
L-luciferina, um enantiômero da D-luciferina (Figura 1), é uma impureza conhecida na luciferina sintética. Enquanto se mostra que funciona nas reacções à luciferase, é provável que ocorra uma mudança significativa no pico de emissão de luz, dependendo dos parâmetros de recolha de dados utilizados. A luciferina é facilmente detectada e quantificada por HPLC quiral e deve ser relatada no certificado de análise do fabricante. A maioria da luciferina deve conter menos de 0,5% de L-luciferina, embora limites mais altos possam provavelmente ser tolerados desde que os níveis de L-luciferina permaneçam constantes durante todo o experimento.
Dehydroluciferin (Figura 1) é uma impureza que atua como inibidor da luciferase, suprimindo a altura de flash e a integração total. Uma amostra dopada com 1% de desidroluciferina mostra menos da metade da altura do flash e menos de 25% da integração total durante 15 minutos. A desidroluciferina pode se formar durante a síntese ou armazenamento da luciferina. Selecionar um fabricante que fornece baixos níveis de desidroluciferina ajudará a garantir resultados confiáveis e repetíveis.
Muitas impurezas vestigiais comuns da síntese de luciferina podem inibir outras enzimas em sistemas complexos e podem causar variabilidade experimental devido a diferenças entre lotes ou entre fabricantes.
Figure 1. Comparação estrutural de D-luciferina e impurezas
Armazenamento
Firefly luciferina é sensível à luz, oxigênio e umidade e deve ser protegida. A luz e o oxigênio podem catalisar a oxidação da luciferina a desidroluciferina. Deixada numa garrafa âmbar sob azoto à temperatura ambiente, a luciferina começará a decompor-se em desidroluciferina após um mês (Figura 2), mas é estável numa garrafa não aberta durante pelo menos dois anos num congelador. Dissolvida em água com oxigênio suficiente, a luciferina se converterá em desidroluciferina em apenas alguns dias.
Luciferina deve ser comprada e armazenada na menor quantidade possível para evitar a decomposição para a desidroluciferina a partir de múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento-aberto. Se comprada a granel, a divisão do reagente de luciferina em frascos âmbar de uso único ajudará a garantir a estabilidade. O armazenamento a longo prazo como solução congelada não é recomendado para aplicações sensíveis, tais como estudos com animais inteiros. Para ajudar a retardar a decomposição em soluções congeladas, espalhe a solução com nitrogênio ou argônio antes do congelamento.
Figure 2. Decomposição da luciferina à desidroluciferina versus tempo a 25ºC e -20ºC
Manuseamento
Quando aberta, a garrafa de luciferina deve ser deixada a temperatura ambiente e depois purgada com nitrogênio ou argônio antes de ser resselada. Se as soluções de luciferina devem ser utilizadas em poucas horas, poucas precauções são necessárias. Soluções que serão usadas durante um dia devem ser poupadas com nitrogênio ou árgon. As soluções não devem ser usadas durante vários dias, pois a formação de desidroluciferina irá ocorrer.
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Scott B. Mohler ([email protected]) é um gerente de produto na Regis Technologies. Website: www.registech.com.