Animais

Todos os ratos eram homens C57BL/6 de 3-11 meses no momento do teste. Os ratos foram adquiridos nos laboratórios Jackson, alojados em instalações com temperatura (22 °C) e controle de luz, e tiveram livre acesso a alimentos e água. Os ratos foram eutanizados através de overdose de isoflurano. Todos os procedimentos e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Carolina do Leste. Os cuidados com animais obedeceram ao Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

Dissecção FDB

Crítica a qualquer procedimento que utilize a FDB é a dissecção cuidadosa que previne danos ao músculo (o músculo é rodeado por uma área de tecido conjuntivo denso) (ver Fig. 1). Para facilitar a dissecção, os dedos dos pés foram fixados a uma prancha de cortiça, fixando o pé no lugar com a sola do pé virada para cima. Em seguida, a pele na extremidade proximal do pé (acima do calcâneo) foi pinçada, permitindo que as microtesouras fizessem incisões ao longo das bordas laterais do pé até os dedos dos pés. Ainda pinçando a pele acima do calcâneo, foram usadas microtesouras para separar a pele da musculatura subjacente. O retalho cutâneo restante foi descascado para trás e removido para expor a FDB e tendões dos dedos. O tendão proximal foi então cortado, e enquanto se segurava o tendão com fórceps, a FDB foi cortada da fáscia subjacente. Os tendões dos dedos foram então cortados para libertar o FDB do pé.

Isolamento da minha fibra

Após dissecção da FDB, os músculos foram colocados em meios de cultura frescos (DMEM com glutamina, 2% FBS filtrado estéril, 0.1% gentamicina) suplementada com 4 mg/ml de colagenase A (Roche – 11088793001) durante 90-120 min a 37 °C em 5% de CO2, como descrito anteriormente. O músculo FDB foi colocado em 2 mL de meio de cultura sem colagenase e suavemente triturado contra a parede do prato para liberar as fibras do feixe usando a ponta cortada de uma pipeta P1000. As miofibras isoladas foram aderidas a pratos de fundo de vidro que foram revestidos com entactina-colagénio-laminina (ECL matriz de fixação celular, #08110 Millipore). As fibras retornaram a 37 °C em 5% de CO2 por várias horas e posteriormente foram imitadas como descrito abaixo.

Comprimento da fibra muscular FDB

Os músculos FDB de ratos C57BL/6 macho e fêmea foram amarrados no tendão proximal e três tendões do dedo do pé medial com sutura de seda e fixados a um clipe metálico para manter a tensão de repouso. As miofibras foram isoladas como descrito acima, mas não foram aderidas a placas de fundo de vidro. As miofibras foram imersas usando uma objetiva ×4 e um microscópio EVOS XL e software de acompanhamento (Life Technologies, Bothell, WA). Os comprimentos de aproximadamente 1000 miofibras foram medidos em ImageJ (versão 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Quando isoladas, as miofibras não estavam mais em tensão e, portanto, não representavam o comprimento ideal. Para contabilizar esta alteração no comprimento da miofibra, foi utilizado um factor de conversão utilizando o comprimento do sarcômero, como descrito anteriormente pelo Dr. Richard Lieber . Quando no comprimento óptimo, o comprimento óptimo do sarcômero do músculo do rato de uma miofibra é de 2,5 μm através de . Para normalizar o comprimento da miofibra para o comprimento do sarcômero, medimos o comprimento do sarcômero em um subconjunto de 30 miofibras. A distância entre 10 sarcômeros de cada miofibra foi medida, e um comprimento médio do sarcômero foi calculado em todas as 30 miofibras. O comprimento ótimo do sarcômero (2,5 μm) dividido pelo comprimento médio do sarcômero medido produziu um fator de conversão de 1,14, que foi utilizado para normalizar todos os comprimentos de miofibras medidos para o comprimento ótimo do sarcômero.

Tipo e tamanho da fibra individual

Análise do tipo de fibra muscular da FDB foi realizada em amostras de ratos C57BL/6, como descrito anteriormente . As seções foram sondadas com anticorpos primários contra miosina de cadeia pesada tipo I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) e antidistrofina (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), em seguida, imergiu usando um microscópio automático EVOS FL e software de acompanhamento (Life Technologies, Bothell, WA). O tipo de fibra e a área da secção transversal da fibra (CSA) foram avaliados usando ImageJ, como descrito anteriormente .

Produção de força isométrica

Produção de força isométrica e fadiga foi avaliada em EDL (n = 5), soleus (n = 4), e FDB (n = 6) músculos dos ratos C57BL/6, como descrito anteriormente com ligeiras modificações. A FDB foi exposta e o tendão proximal foi fixado com sutura de seda. A pinça de ponta fina foi colocada sob os três tendões do dedo do pé medial e puxada suavemente para baixo em direção aos dedos dos pés antes dos três tendões (Fig. 1) serem fixados com sutura de seda. Amarramos os três tendões mediais porque não é possível amarrar um dos dedos devido à localização anatômica, e amarrar o quarto tendão não resulta, em nossa experiência, em uma força absoluta diferente (dados não mostrados). Cada tendão foi então cortado logo acima do nó, e a FDB foi suavemente levantada para longe do pé. Micro tesouras foram usadas para remover qualquer tecido conjuntivo restante, liberando-o do pé. O músculo foi então amarrado a um transdutor de força e suspenso em Krebs Ringer Buffer oxigenado (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) à temperatura ambiente. O comprimento muscular foi então ajustado até que o FDB produzisse um pico de força de contração, em cujo ponto a tensão de repouso ótima (Lo) foi definida e o músculo foi deixado em equilíbrio por 10 min. Os músculos soleus foram preparados atando um nó quadrado duplo no tendão distal do solado. O tendão foi cortado acima do nó e os músculos posteriores foram suavemente afastados da perna revelando o tendão da sola proximal, que foi atado com um nó quadrado duplo. O EDL foi dissecado e atado como descrito anteriormente. A LED e os músculos do solado foram equilibrados em temperatura ambiente oxigenada KRB em repouso por 10 min. Após o equilíbrio, a tensão muscular foi otimizada através da realização de estímulos máximos de contração e ajuste do comprimento do músculo até o pico de força ser atingido. As estimulações de contração foram realizadas com 30 s de intervalo para evitar a fadiga do músculo. Os músculos foram então estimulados com 60 s de distância a 10, 20, 40, 60, 80, 100, e 120 Hz para gerar uma curva de frequência de força. Os músculos foram descansados por mais 1 minuto antes de completar um protocolo de estimulação de 10 minutos para determinar a resistência à fadiga. O protocolo de fadiga estimulou os músculos a 30 Hz a cada 2 s durante um período de 600 s para um total de 300 contracções. O comprimento muscular ideal foi registrado e os músculos foram manchados para remover o excesso de KRB antes de serem pesados. Uma tensão óptima de 20 V foi estabelecida antes das experiências para assegurar a estimulação máxima da FDB, EDL e do solado (dados não mostrados). Dados de força muscular absoluta foram convertidos em força específica (N/cm2) usando equações previamente descritas para a estimativa matemática da CSA muscular e da área transversal fisiológica (PCSA). A principal diferença entre CSA e PCSA é a inclusão da relação entre o comprimento da fibra muscular e o comprimento do músculo na equação PCSA. Utilizamos os dois métodos corrigidos para proporcionar uma compatibilidade mais ampla com a literatura.

Passive contractile properties

Passive contractile properties were assessed in EDL and FDB muscles from C57BL/6 male mice (n = 4), as previously described , with slight modifications. Os músculos EDL e FDB dissecados e amarrados a um transdutor de força, como descrito acima. Os músculos foram equilibrados durante 10 min em KRB oxigenado à temperatura ambiente. Após o equilíbrio, a tensão muscular foi otimizada através da realização de estímulos máximos de contração e ajuste do comprimento do músculo até o pico de força ser atingido. As estimulações de contração foram realizadas com 30 s de intervalo para evitar a fadiga muscular. O comprimento de referência muscular foi medido como o Lo antes de sofrer um alongamento passivo de 105, 110, 115, 120, 125 e 130% de Lo. Os músculos foram manchados para remover o excesso de KRB e depois pesados. Os dados foram corrigidos para CSA e PCSA.

Lesão por Cardiotóxina (CTX)

Comparações foram feitas em ratos C57BL/6 entre um FDB tratado com CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) e um FDB contralateral tratado com PBS 4 dias (n = 4) e 10 dias pós-tratamento (n = 2). Foram preparadas seringas estéreis de 31G de 8 mm de comprimento com 10 μL de 10 μM CTX ou 10 μL de PBS 1× estéril, conforme descrito anteriormente . Após anestesia induzida por isoflurano, a base dos pés de quatro ratos foi limpa com toalhetes a álcool. A CTX foi injetada na porção proximal do pé com a agulha posicionada sob a pele e em direção aos dedos dos pés. A PBS foi injetada no pé contralateral. Os camundongos foram sacrificados no momento apropriado, e os FDBs foram dissecados para a medida da produção de força, como descrito acima. Os dados foram corrigidos para PCSA.

Hematoxilina e coloração de eosina

Músculos FDB submetidos a 10 dias de tratamento com CTX foram congelados em solução de temperatura de corte ótima (TOC) para secção e coloração de H&E, como descrito anteriormente .

Skeletal muscle high resolution mitochondrial respirometry

Preparação de feixes permeabilizados de fibras musculares gastrocnemius e FDB

Respirometria foi realizada em feixes musculares permeabilizados isolados de gastrocnemius e FDB excisados do mesmo membro de camundongos C57BL/6 (n = 4). Uma porção do gastrocnêmio vermelho foi dissecada e utilizada para a preparação dos feixes de fibras permeabilizadas, conforme descrito anteriormente. O músculo gastrocnêmio vermelho foi utilizado como tecido comparativo, pois é comumente usado para avaliar a respiração mitocondrial do músculo murino esquelético. O protocolo de preparação dos feixes de fibras musculares permeabilizadas FDB foi adaptado dos métodos descritos anteriormente sobre a permeabilização dos feixes de músculos gastrocnêmios vermelhos e é descrito abaixo. Os FDBs foram dissecados e imediatamente adicionados ao tampão gelado X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurina, 5,7 ATP, 14,3 fosfocreatina, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Usando um microscópio dissecante, tecido conjuntivo, gordura e vasos sanguíneos foram removidos cuidadosamente para evitar perda muscular. Os FDBs foram cortados em feixes e divididos em grupos de três a quatro feixes, pesando 1,5-2,0 mg de peso úmido. Os grupos de feixes foram então permeabilizados em tampão X contendo 22,5 μg/ml de saponina com rotação contínua a 4 °C durante 5 min. Os feixes musculares foram imediatamente transferidos para o tampão gelado Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) e lavados com rotação contínua a 4 °C durante 15 min.

Expiração mitocondrial

Medições de consumo de O2 de alta resolução foram feitas usando o Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria) a 37 °C com uma concentração inicial de oxigênio de ~ 300-350 μM como descrito anteriormente . Foram realizadas experiências em tampão Z contendo 20 mM de creatina monohidrato e 25 μM blebbistatina. A respiração mitocondrial foi avaliada pela adição sequencial de substratos a uma concentração final de piruvato 4 mM, malato 0,5 mM, glutamato 5 mM, ADP 2.5 mM, succinato 5 mM, citocromo c 5 μM, rotenona 10 μM, antimicina A 5 μM, ácido ascórbico 2 mM, e TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato). A integridade da membrana mitocondrial foi confirmada pela exclusão dos feixes musculares gastrocnêmicos e FDB que produziram um aumento de > 10 ou > 20% na respiração, respectivamente, após a adição de citocromo c exógeno. Um critério de exclusão diferente foi utilizado para os feixes musculares gastrocnêmicos e FDB, pois testes preliminares indicaram que um maior percentual de aumento na respiração foi comum nos feixes de fibras FDB em comparação com os feixes de fibras gastrocnêmicas, após a adição de citocromo c. Após a conclusão do protocolo, os feixes musculares foram enxaguados em H2O destilado, liofilizados (Labconco, Kansas City, MO) e pesados (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). As taxas de respiração dos feixes musculares intactos do gastrocnêmio são comumente corrigidas para peso seco; entretanto, devido às diferenças no conteúdo de tecido conjuntivo dos dois grupos musculares, os valores de JO2 também foram corrigidos para a atividade proteica total e citrato-sintase (CS). A atividade do CS foi medida utilizando o kit CS0720. Produtos químicos e reagentes foram adquiridos da Sigma Aldrich.

Microscopia

In vitro

FDB fibras musculares foram isoladas de camundongos C57BL/6 e fixadas em pratos de fundo de vidro de 35 mm revestidos com ECL, como discutido anteriormente. As miofibras isoladas foram coradas com mitotracker vermelho profundo (M2246, Thermo Fisher) e NucBlue (R37605, Thermo Fisher) em DMEM durante 30 min. As fibras foram lavadas três vezes com 2 mL KRB. As fibras foram imersas usando um microscópio de varredura a laser confocal de fóton único com uma objetiva de imersão de óleo ×60 (Olympus, Plan Apochromat, NA 1.35) e a excitação foi obtida usando as linhas 405- e 488-nm de um laser de argônio multilinha.

In vivo

Segunda geração harmônica descreve o efeito óptico produzido a partir da passagem dos pulsos do laser através de materiais altamente polarizados, não centrossimétricos, como a miosina. Quando polarizados no comprimento de onda apropriado, estes materiais emitem luz à metade do comprimento de onda daquele que entra, produzindo imagens de alta resolução sem a necessidade de sondas fluorescentes que estão sujeitas a fotobleaching e fototoxicidade. Além disso, os comprimentos de onda quase infravermelhos utilizados permitem a penetração profunda dos tecidos sem a necessidade de procedimentos invasivos. Os ratos C57BL/6 foram anestesiados antes de se remover a pele que cobre a FDB, expondo o músculo FDB. Uma vez exposto, o FDB foi hidratado com KRB estéril e o rato foi colocado sobre um deslizamento de cobertura de vidro (#1,5, Leica), como descrito anteriormente (Fig. 1C). As moléculas contendo miosina e nicotinamida foram excitadas a 900 e 720 nm usando um modo bloqueado Ti:Sapphire pulsado laser (Mai Tai Deep See série HP, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), e a emissão foi registrada usando a detecção não-descaminhada com um filtro FV10 MRV/G ajustado a 450 e 420 nm, respectivamente. Todas as imagens foram obtidas utilizando uma objectiva de imersão de óleo ×60 (Plan Apochromat, NA 1.35) e um software de aquisição Olympus FV1000 LSM que opera com o FV10-ASW 4.2.

cDNA eletroporação e respiração de alta resolução do músculo esquelético superexpressor Pgc1α

Electroporação do cDNA em FDBs foi realizada como descrito anteriormente . Em resumo, os pés de sete ratos anestesiados C57BL/6 machos e fêmeas foram limpos com um toalhete alcoólico e os pés foram injetados com 10 μl de 2 mg/mL de hialuronidase suspensa em KRB filtrada estéril com uma agulha estéril de 8 mm de comprimento e 31 mm de comprimento. Aproximadamente 1 h, mais tarde os ratos foram submetidos à anestesia pela segunda vez. Os pés foram novamente limpos com um toalhete alcoólico e um pé recebeu 30 μg de proteína verde fluorescente (GFP)-tagged PGC1α plasmídeo e o pé contralateral foi injetado com YFP cDNA. Após uma recuperação completa da anestesia, os ratos foram anestesiados pela terceira vez ~ 10 minutos depois. Os eletrodos de platina foram inseridos sob a pele e posicionados perpendicularmente ao FDB e paralelos um ao outro no calcanhar e no pé, abaixo dos dedos dos pés. O FDB foi estimulado com 20 pulsos de 20 ms de duração a 1 Hz e 100 V . Os ratos foram sacrificados 14 dias depois, e os FDBs foram dissecados e imitados sob um microscópio fluorescente para confirmar a expressão plasmídica. Amostras íntegras de músculo FDB foram então preparadas e medidas para a respiração mitocondrial como esquema acima.

Estatística

As distribuições de dados foram avaliadas e os dados que não estavam de acordo com uma distribuição normal foram transformados em log base 10. Os dados contráteis de freqüência de força foram analisados através de ANOVA bidirecional com comparações múltiplas de Tukey. Massa muscular, tipo de fibra, tempo para máxima e meia-relação e dados de fadiga foram analisados através de ANOVA unidirecional com comparações múltiplas de Tukey. Nos casos em que os dados não puderam ser transformados para uma distribuição normal, foi realizado um teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn. As ANOVAs foram completadas utilizando o Prisma GraphPad 7.03. Os dados respiratórios e a atividade CS foram analisados através de testes t pareados de duas caudas com um nível alfa de 0,05 usando o Microsoft Excel. Todos os dados são apresentados como média ± SEM.