Estratégias empregadas na regulação dos diferentes reagentes

Os mecanismos de regulação gênica por sinalização de morfógenos devem fornecer ameanos para traduzir pequenas diferenças na força do sinal em eirasponses em que todas ou nenhuma mudanças na expressão gênica permitem a seleção de identidades celulares discretas no tecido em desenvolvimento. Mais de uma geraçãoago, estratégias que poderiam explicar este fenómeno foram propostas (Monod e Jacob, 1961), e algumas destas ideias começam a reaparecer de estudos moleculares mais recentes. Tentamos categorizar essas estratégias em características gerais de desenho que podem explicar a regulação diferencial do gene por meio de gradedsignalling (Fig. 2). Claramente, existem sobreposições entre estas categorias e a lista não é exaustiva. É evidente que a maioria, se não todas, das vias de morfogênese bem estudadas utilizam uma combinação desses mecanismos para controlar a expressão gênica alvo. Para ilustrar as principais características de cada uma das estratégias, delineamos exemplos do seu uso na interpretação de morfogengrados específicos.

Afinidade do local de ligação

Um mecanismo importante que tem sido extensivamente investigado explorando as diferenças na afinidade do efetor transcripcional para ligar tositos com diferentes seqüências de DNA (Fig. 2A). Um paradigma para isso é o gradiente de Dl no embrião Drosophila inicial, que direciona a patterização e gastrulação DV através da ativação e repressão dos genes alvo dependentes da concentração (Stathopoulos e Levine,2004). Estudos extensivos de intensificadores específicos que respondem a limiares de Dl atuais revelaram um quadro detalhado da regulação do mecanismo dos genes. Com base na sua capacidade de resposta ao Dl, os genes alvo foram classificados em diferentes categorias. Genes tipo I, tais astwist (twi) são ativados na mesoderme presumida onde há níveis de pico de Dl nuclear (Fig.1C). Os melhoradores desses genes tendem a ter locais de baixa afinidadeDl que só são ocupados com a maior concentração de Dl, limitando assim a expressão dos genes tipo I à mesoderme presumível (Jiang e Levine, 1993). Bycomparison, realçadores dos genes tipo II, como o rombóide (Fig. 1C), contêm sítios de ligação Dl de alta afinidade que são ligados e ativados pelos níveis mais baixos de Dl que estão presentes no neuroectoderm ventral(Ip et al., 1992a). A análise computacional recente de um grande conjunto de intensificadores de Dl-responsive enhancers from thegenomes of D. melanogaster and related species confirmou que a Dlaffinity é um determinante importante dos domínios de expressão dos genes alvo de Dl (Papatsenko e Levine, 2005). Em alguns casos, Dl ligado a um local de alta afinidade também pode reprimir a transcrição, indicando que a arquitetura melhorada também desempenha um papel significativo na determinação da resposta dos genes ao Dl (Stathopoulos e Levine,2004). Além disso, as interações cooperativas entre Dl e outros fatores também influenciam significativamente a responsividade de alguns genes.

Um segundo exemplo é a interpretação do gradiente Bcd, que é responsável pela regulação da atividade gênica ao longo do eixo anteroposterior (AP) no embrião Drosophila. Estudos iniciais de interpretação de Bcd identificaram a afinidade dos sítios de ligação de Bcd como um determinante chave para estabelecer os limites de expressão do gene alvo hb(Fig. 1B). A diminuição da Bcdaffinity leva a um padrão de expressão mais anterior restrito onde os Bcdlevels são mais altos. Assim, um modelo foi proposto para a interpretação do gradiente de Bcd, no qual genes com expressão anterior restrita têm baixa afinidade Bcd em seus sítios de ligação e consequentemente requerem uma alta concentração de Bcd para ocupação e ativação. Por outro lado, os sítios de maior afinidade no realçador de hb permitem a expressão em posições moreposteriores onde a concentração de Bcd é menor (Driever et al., 1989; Struhl et al., 1989). O suporte desse modelo, o gene ortodôntico, que é regulado por meio do realçador de afinidade Bcd baixo, tem um padrão de expressão estreito(Gao et al., 1996)(Fig. 1B).

Não é apenas no embrião pré-celular que a resposta dos genes ativados pelo fator de transcrição togradimensional utiliza a afinidade entre o local de ligação e o embrião. Este mecanismo também é relevante em configurações mais convencionais pós-celularização, como a interpretação do gradiente extracelular de Dpp no embrião Drosophila. Em resposta aos níveis de pico de Dpp sinalizando na linha média dorsal do embrião, o gene alvo Race é expresso em uma faixa estreita de células na suposta amnioserosa (Fig. 1D). O intensificador responsável por esta atividade contém locais de ligação de baixa afinidade para o Mad, o efetor transcricional do Dpp. Alterando esses locais para aumentar a teafinidade para Mad amplia o padrão de expressão associado a essa característica dos genes que são sensíveis a um limiar inferior de Dppsignalling (Wharton et al.,2004).

Informações combinatórias

Afinidade entre locais de ligação pode ser responsável por alguns dos gradientes de morfogênese; entretanto, em geral, a afinidade por si só é insuficiente para direcionar o complemento total das respostas transcripcionais. Por exemplo, embora a afinidade dos sítios de ligação de Bcd estabeleça os limites de expressão do gene hbtarget (Driever et al.,1989; Struhl et al.,1989), um estudo computacional de uma amostra maior de módulos Bcdcis-regulatórios indica que para a maioria existe uma fraca correlação entre a força dos clusters de ligação de Bcd e os limites de expressão do agene. Além disso, apenas alguns genes alvo parecem ser ativados apenas pelo Bcd, e a expressão desses genes é restrita às partes mais anteriores do embrião que contêm níveis de Bcd de pico (Ochoa-Espinosa et al., 2005), como observado para um repórter sintético contendo apenas locais de ligação de Bcd (Crauk e Dostatni, 2005). Em vez disso, outros elementos intarget genes promotores e a integração de entradas positivas e negativas das proteínas ligadas a esses elementos podem determinar a interpretação do gradiente de Bcd. Para genes ativados nas regiões médias e pósteriores do embrião, a maioria dos genes alvos de Bcd tendem a ter inputs adicionais dos fatores de transcrição Hb, Caudal (Cad) e/ou Krüppel (Kr) (Ochoa-Espinosa etal., 2005). Hb e Cad são expressos maternalmente e zigoticamente ativados e reprimidos por Bcd nos níveis transcripcional e translacional, respectivamente (Driever e Nusslein-Volhard, 1989; Dubnauand Struhl, 1996; Rivera-Pomaret al., 1996). Ambos Hb e Cad aumentam a ativação transcricional dependente de Bcd- (La Rosee etal., 1997; Simpson-Brose etal., 1994). Portanto, o gradiente Bcd pode funcionar com Hband/ou Cad para estabelecer um domínio amplo onde a ativação do intensificador pode ocorrer, e o balanço de entradas positivas e/ou negativas destes e de outros fatores de transcrição determinaria os limites de um domínio de expressão (Ochoa-Espinosa et al., 2005). Além disso, como sítios de ligação para outros efeitos transcripcionais, a disposição dos sítios de ligação de Bcd também influencia a expressão gênica, e os dados indicam que o Bcd se liga cooperativamente ao DNA. Portanto, a ligação de Bcd a um sítio de alta afinidade potencializa a ligação a um sítio adjacente de baixa afinidade (Burz et al., 1998). Expressão de uma proteína Bcd com uma mutação que interrompe a cooperatividade nas células embrionárias para uma mudança anterior nos padrões de expressão dos genes alvo, como a cinza, e reduz a nitidez de suas bordas posteriores (Lebrecht et al., 2005).

A integração dos inputs de Dl e de outros fatores de transcrição também influencia a resposta dos genes ao longo do eixo DV do Drosophilaembryo. Uma análise dos melhoradores de genes alvo de Dl em diferentes Drosophilids (Papatsenko e Levine, 2005) revelou que, assim como os genes limiar tipo I tendem a ter menor Dlaffinity do que os genes tipo II, há uma tendência similar nesses promotores para a afinidade de outro fator de transcrição, Twi. Além disso, os limiares do tipo II tendem a ter uma orientação e espaçamento fixos entre os sítios Dl e Twi. Isto é consistente com a ocorrência de interação sinérgica entre os fatores de transcrição de Dl e Twi sendo importante para a ativação dos alvos tipo II no neurectoderme onde os níveis de Dl e Twi são baixos (Papatsenko e Levine, 2005).Os melhoradores tipo II geralmente têm um input positivo adicional do ativador sem cabelos (Erives e Levine, 2004) e um input negativo do repressor de caracóis. o caracol é um gene alvo de Dl que é ativado na mesoderme presumível (Ip et al, 1992b), excluindo assim a expressão dos genes do tipo II da mesoderme (Kosman et al., 1991). Incontraste aos melhoradores do tipo II, há uma correlação negativa entre a qualidade dos sítios Dl e Twi nos melhoradores do tipo I, ou seja, um bom sítio Dl está associado a um sítio Twi pobre, e vice versa. Isto sugere que, naqueles melhoradores onde há níveis de pico de Dl e Twi, os ativadores funcionam de forma compensatória (Papatsenko andLevine, 2005). É importante ressaltar que estudos com intensificadores sintéticos também indicam que a presença de locais de Twi e Dl leva a um padrão de expressão mais acentuado, em comparação com o padrão mais fraco e difuso observado com Dlalone (Szymanski e Levine,1995). Assim, fica claro que além da afinidade dos sítios de ligação para o principal efeito transcripcional de um morfógeno, a integração de inputs positivos e negativos em um intensificador é um determinante importante das respostas de limiar (Fig.2B).

Laçadas de alimentação para frente

A inclusão de inputs combinatórios no controle da expressão diferencial de genes permite que relações regulatórias complexas se desenvolvam entre os genes correspondentes. Uma dessas relações é o loop feed-forward(Fig. 2C), um exemplo do qual foi descrito recentemente para a ativação da Raça por Dppsignalling. Além da afinidade dos locais de ligação Mad-binding no melhorador da raça (Wharton et al.,2004), o fator de transcrição Zerknüllt (Zen) desempenha um papel acrucipal na ativação da Raça. Zen e Mad ligam-se aos sítios adjacentes no realçador da raça, e uma interação direta entre eles énecessária para a ativação da raça (Xuet al., 2005). zen é um gene regulado por Dpp que depende dos níveis de pico de sinalização Dpp (Rushlow et al., 2001). Assim, para que a Raça seja induzida, níveis de pico de sinalização Dpp precisam ativar altos níveis de Mad e induzir a expressão Zen, que funcionam juntos para ativar a Raça (Xu etal., 2005). Este tipo de rede genética regulatória, na qual o fator de transcrição X ativa o fator de transcrição Y, e juntos X e Y ativam o alvo Z, é chamado de loop de avanço (Lee et al., 2002).

O loop de avanço Mad-Zen pode representar uma estratégia geral que é usada para ativar outros genes de alvo Dpp de pico (Xu et al., 2005). É importante notar que os loops de alimentação-forward operam em outras redes de genes que respondem a outros genes. Por exemplo, Twi, que funciona com genes Dlto reguladores ao longo do eixo DV, é codificado por um gene Dl-responsive (Jiang e Levine, 1993). A ocorrência de loops feed-forward na interpretação dos gradientes morfogênicos do embrião Drosophila inicial sugere que seu tipo de circuito regulador é particularmente adequado para a interpretação dos gradientes. Os dados de outros sistemas revelam que os loops de alimentação-forward são úteis para a discriminação entre sinais externos erráticos para garantir que a ativação ocorra apenas em resposta à sinalização persistente, fornecendo assim um meio de amortecer pequenas flutuações no sinal (Shen-Orr et al.., Além disso, a exigência de co-incidência inerente aos loops de alimentação pode também fornecer respostas altamente sensíveis a pequenas mudanças no nível do sinal (Goldbeter e Koshland,1984), uma característica que permitiria que as respostas de limiar fossem geradas em resposta a pequenas mudanças na força de sinalização inicial.

Retroalimentação positiva

A autoregulação de, ou loops de feedback positivo (verFig. 2D) em, genescan respondendo também desempenha um papel na interpretação de gradiente e fornece um mecanismo para a geração de todas ou nenhuma resposta em níveis limiares de sinalização. Um exemplo característico disto é a regulação de Hoxb4 no cérebro traseiro vertebrado (Gould et al.,1998; Gould et al.,1997). Um gradiente de ácido retinóico (AR) confere informação posicional ao longo do eixo AP do cérebro traseiro do vertebrado formador e é responsável pela determinação do limite anterior de indução de Hoxb4. O RA ativa os receptores do RA nuclear (RARs), e estes receptores ligam-se a uma região melhoradora definida no locus Hoxb4 para ativar a itsexpressão. Em estágios iniciais do desenvolvimento do cérebro traseiro, este mecanismestablata uma borda de expressão anterior difusa do Hoxb4. Um segundo elemento realçador, o elemento realçador tardio, dentro do locus Hoxb4 responde à própria proteína Hoxb4. Portanto, em estágios posteriores de desenvolvimento, após a indução mediada por RA de Hoxb4, este elemento responde ao Hoxb4 induzido e é suficiente para direcionar a expressão deste gene até o limite anterior normal de expressão gênica. Assim, a atividade classificada da RA inicia a expressão Hoxb4, a auto-regulação mediada pela Hoxb4 refina e mantém sua expressão como um progresso no desenvolvimento do cérebro traseiro. Hoxb4 regula RARβ de forma semelhante, indicando que existe um circuito de feedback positivo areciprocal entre estas proteínas que geram e mantém os limites discretos da expressão de Hoxb4 (Serpente et al., 2005).

Repressão cruzada

Interações repressivas entre genes regulados por morfógenos também são importantes para a interpretação do gradiente (Fig.2E). Um exemplo bem estudado é a contribuição da repressão cruzada para a partição do neuroectoderm Drosophila em três colunas ao longo do eixo DV (Cowdenand Levine, 2003). Esta subdivisão é mediada por três fatores homeoboxtranscrição (Vnd, Ind e Msh) que demarcam as colunas ventral, intermediária e dorsal, respectivamente. Os limiares distintos de Dlsignalling induzem esses genes, mas a produção das distintas colunas de expressão do gene, que são delimitadas por mudanças abruptas na expressão de cada proteína homeodominada, depende da interação cruzada assimétrica entre essas proteínas. Desta forma, as proteínas homeodominais expressas nestes domínios mais ventrais reprimem aquelas expressas mais dorsalmente. Assim, aumentos incrementais na sinalização Dl resultam na ativação seqüencial de cada gene e na correspondente repressão dos genes induzidos por níveis mais baixos de Dl-atividade – um processo que tem sido chamado de `domínio ventral’.

O sistema nervoso vertebrado exibe uma variação sobre este motivo regulador que envolve o uso de repressores cruzados mútuos, ou feedback negativo recíproco, entre pares de genes. As células do tubo neural vertebrado respondem à sinalização Shh graduada regulando a expressão de uma série de fatores de transcrição que incluem os ortologues homeodominais de Vnd, Ind e Msh (Briscoe e Ericson,2001). Com base no seu modo de regulação pela sinalização Shh, esses fatores de transcrição são divididos em dois grupos, denominados de classes I e IIproteínas. A expressão de cada proteína de classe I é extinta em diferentes limiares de atividade Shh; inversamente, a expressão das proteínas de classe II depende da sinalização de Shh. In vivo, os padrões de expressão desses genes dividem o tubo neural ventral em domínios marcadamente demarcados que lembram os vistos em Drosophila, com o limite ventral da maioria das proteínas de classe I correspondendo ao limite dorsal de expressão de uma proteína de classe II. Isto é conseguido através de interações seletivas cruzadas entre os pares complementares de proteínas de classe I e classe II expressas em domínios adjacentes (Briscoe et al.,2001; Briscoe et al.,2000). Tanto no sistema nervoso vertebrado quanto no de Drosophila (Cowden e Levine,2003), as interações repressivas estabelecem os limites de expressão gênica e geram os limites agudos de expressão gênica que resultam em um domínio progenitor que expressa um conjunto distinto de fatores de transcrição. Este mecanismo converte um gradiente de informação posicional em mudanças discretas ou não na expressão gênica.

O princípio das interações regulatórias cruzadas também é observado em outros tecidos em desenvolvimento, indicando que ele pode representar uma estratégia geral empregada para interpretar a informação posicional graduada. Os gradientes Bcd especificam os domínios de expressão dos genes Gap, que posicionam os genes de polaridade de pares e segmentos necessários para a segmentação do embrião (Jäckle et al.,1986; Kraut e Levine,1991). Tanto a interação assimétrica como a recíproca e repressiva entre os genes Gap parecem formar um circuito intrincado. Uma forte reciprocidade de expressão entre pares de genes garante a exclusividade mútua de expressão, enquanto a repressão assimétrica dos genes Gap anteriores por genes mais posteriores para um deslocamento anterior em seus limites posteriores (Jaeger et al., 2004; Monk, 2004)(Fig. 2E). Estes achados iluminam uma característica dinâmica da interpretação do gradiente Bcd, onde os domínios espaciais da expressão gênica podem ser reposicionados por interações subseqüentes assimétricas entre genes Gap.

Gradiente repressor repressor recíproco

Uma característica comum de muitos gradientes morfogênicos é o estabelecimento de um gradiente inverso de um repressor transcripcional que é recíproco ao efetortranscripcional ativado pelo sinal(Fig. 2A). No caso da sinalização de Shhand Wnt, os efeitos transcripcionais primários desses repressores transcripcionais na ausência de sinalização são convertidos para ativadores transcripcionais na sinalização(Giles et al., 2003; Jacob e Briscoe, 2003). O efeito da sinalização, então, é a formação de um gradiente de ativador transcripcional com um gradiente repressor oposto, uma estratégia que poderia aumentar as mudanças na atividade transcripcional mediada pelo morfógeno. Uma variação desta estratégia é empregada na interpretação do gradiente de Dpp no disco imaginal da asa Drosophila. Aqui, o papel principal do sinal de Dpp parece ser a criação de um gradiente recíproco da proteína repressora Brinker (Brk). Mad e Medea reprimem diretamente Brk em um complexo com o fator de transcrição deSchnurri (Pyrowolakiset al., 2004), e a sensibilidade à repressão de Brk estabelece os limites de expressão das respostas do limiar de Dpp, incluindo spalt(sal) e optomotor-cego (omb)(Muller et al., 2003).omb é reprimido em clones mutantes loucos porque a derepressão de Brk. Entretanto, em clones duplos mutantes loucos de Brk há ativação ectópica do omb, indicando que, para ombexpressão, o único requisito para sinalização Dpp é reprimir Brk. Bycontrast, expressão de níveis máximos de sal, requer um input positivo dos Smads (Affolter et al.,2001; Barrio e de Celis,2004). Em outros contextos de desenvolvimento, Mad e Brk foram fundados para competir pelos mesmos sítios de ligação (Affolter et al., 2001), embora a relevância disso para o estabelecimento dos domínios de expressão do gênero alvo da asa não seja clara.