Culturas de células e RNAi

A linha de células Drosophila melanogaster S2 (da coleção de IMG RAS) e Kc167 (do Drosophila Genomics Resource Center) foram cultivadas a 25 °C no Drosophila Medium (Gibco) da Schneider suplementado com 10% de calor…soro fetal bovino inactivado (FBS, Gibco), 50 unidades/ml de penicilina, e 50 µg/ml de estreptomicina. OSCs47 gentilmente fornecidas por M. Siomi foram cultivadas em Shields e Sang M3 insect medium (Sigma-Aldrich) suplementadas com 10% de FBS (Gibco) ativado pelo calor, 10% de extrato de mosca (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml de glutationa (Sigma-Aldrich), 50 unidades/ml de penicilina, e 50 µg/ml de estreptomicina. Os dsRNAs contra lacZ ou lamina Dm0 para tratamento RNAi de células S2 foram preparados como descrito anteriormente11. Os dsRNAs contra LBR foram preparados da mesma forma usando o DNA do genoma Drosophila como modelo para amplificação de PCR e primers fornecidos na Tabela Suplementar 1. O tratamento das células com dsRNA foi realizado durante quatro dias usando um protocolo previamente descrito48,

Análise de Western-blot-blot

Proteínas foram extraídas com 8 M de uréia, 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,0, 1% de SDS, fracionado por SDS-PAGE (12% de gel de acrilamida) e transferido para uma membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore). Os bloqueios foram desenvolvidos utilizando anticorpos secundários conjugados com fosfatos alcalinos (Sigma) e o sistema de detecção AP Immun-Star (Bio-Rad). Os seguintes anticorpos foram usados para detecção: murino monoclonal anti-lamin Dm0 (1:2000; ADL6749), coelho policlonal anti-lamin C25 (1:10000), murino monoclonal anti-beta actina (1:3000; ab8224, Abcam).

Visualização da cromatina por coloração histone H4 ou DAPI

Lam-KD, LBR-KD ou células S2 controle foram semeadas em lamelas durante 30 min. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas em metanol a 100% durante 5 min. à temperatura ambiente (para exame posterior da distribuição de cromatina com base na coloração de histona H4) ou em formaldeído a 4% em PBS durante 25 min. à temperatura ambiente (para estimativa posterior do volume de cromatina com base na coloração DAPI), lavadas com PBS três vezes, bloqueadas com PBTX (PBS com 0,1% Tween-20 e 0,3% Triton X-100) contendo 3% de soro normal de cabra (Invitrogen) durante 1 h à temperatura ambiente. O restante procedimento imunológico foi realizado como descrito anteriormente50. Como anticorpos primários utilizamos o anti-histone monoclonal murino H4 (1:200; ab31830, Abcam), anti-LBR26 (1:1000), anti-lamin Dm051 (1:500) de porco-da-índia, anti-lamin Dm051 de coelho. Como anticorpos secundários utilizamos o Alexa Fluor 546 conjugado com IgG (Invitrogen) ou Alexa Fluor 488 conjugado com IgG (Invitrogen), ou Alexa Fluor 633 conjugado com IgG (Invitrogen) de cabra anti-guinéola de porco da espécie caprina.

ImageJ quantificação da distribuição de cromatina

Utilizando ImageJ, medimos os perfis histone H4, LBR e lamina Dm0 através do diâmetro do núcleo do plano focal equatorial dos núcleos das células Lam-KD, LBR-KD ou controle S2. As intensidades fluorescentes foram extraídas, os perfis individuais foram primeiro normalizados na intensidade média, depois no diâmetro do núcleo (delimitados por picos de fluorescência LBR para Lam-KD, ou por picos de fluorescência Dm0 da lâmina para LBR-KD) e posteriormente alinhados para determinar o perfil médio. Núcleos de 2-3 experimentos independentes (60 núcleos por experimento) foram analisados.

Estimativa do volume de cromatina colorida por DAPI

Imagens focais contendo 20-30 células de Lam-KD fixadas por DAPI ou células S2 de controle foram processadas e analisadas com os mesmos parâmetros usando o software IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). Apenas os núcleos com a menor coloração residual da lâmina Dm0 foram utilizados para análise nas células Lam-KD, enquanto que nas células controle, ao contrário, os núcleos com má coloração da lâmina Dm0 não foram utilizados para análise. Para a subtração de fundo, as imagens foram limitadas a ~15% da intensidade máxima do canal, para que as superfícies nucleares geradas não se expandissem além do pico de intensidade da fluorescência LBR. Com estes parâmetros, as superfícies dos núcleos, apropriadas para análise, foram automaticamente reconstruídas. Finalmente, os volumes de ~100 núcleos reconstruídos foram recuperados da guia Estatísticas para a análise.

FISH de duas cores

~20-kb As sondas FISH foram geradas usando um kit PCR de longo alcance (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) por PCR-amplificação de 4 fragmentos de genoma de revestimento cobrindo ou a região 2 L:16964000-16982000 ou 2 L:17310000-17328000, com o uso de pares de primer fornecidos na Tabela Suplementar 1. 1 µg de DNA modelo para hibridação foi rotulado por síntese de primer aleatório com o kit de rotulação de DNA DIG (Roche) ou por ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). As sondas foram ainda combinadas e hibridizadas com células S2 como descrito anteriormente23. Para a detecção de sondas NL ou FISH, como anticorpos primários utilizamos o anti-LBR26 (1:1000) de cobaia, ou o anti-lamin Dm051 (1:500) de coelho e o anti-DIG-FITC (1:500, Roche) policlonal de ovelha. Como anticorpos secundários utilizamos o Alexa Fluor 633 conjugado com IgG (Invitrogen) de cabra, ou Alexa Fluor 546 conjugado com IgG (Invitrogen) de cabra e Alexa Fluor 488 conjugado com IgG (Invitrogen) de cabra anti-FITC.

Medição das distâncias entre as sondas FISH e o NE

Pilhadas de imagens tridimensionais foram gravadas com um microscópio confocal LSM 510 Meta laser scanning (Zeiss). Foram capturadas secções ópticas com intervalos de 0,4-μm ao longo do eixo Z. As imagens foram processadas e analisadas através do software IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) com a configuração experimental cega. As distâncias entre ambas as sondas ou entre as sondas e o NE foram contadas como descrito anteriormente23. Resumidamente, não foi possível reconstruir completamente as superfícies dos núcleos automaticamente com base na sua imunoglobulina LBR ou lamina Dm0. Portanto, a borda nuclear de um determinado núcleo foi delineada manualmente em todas as seções ópticas da pilha pelo meio de sua LBR ou lamina Dm0 para reconstruir a superfície deste núcleo automaticamente. Para determinar a distância entre os sinais FISH e o NE, o instrumento “ponto de medição” foi posicionado no voxel mais brilhante da sonda FISH e outro “ponto de medição” foi posicionado na superfície nuclear reconstruída no ponto de sua primeira interseção com uma esfera progressivamente crescente a partir do primeiro “ponto de medição”. A distância entre dois “pontos de medição” (ou seja, a distância mais curta entre o centro da sonda FISH e o meio do NE) foi medida para cada núcleo. As distâncias entre duas sondas FISH foram medidas de forma correspondente. Os dados foram obtidos em dois experimentos independentes para 75-100 núcleos por experimento. Em paralelo, volumes de núcleos foram recuperados, e raios de núcleos foram calculados considerando os núcleos como sendo esféricos. Finalmente, as distâncias foram normalizadas para os raios nucleares.

Análise de expressão gênica

RNA total foi isolado das células Lam-KD ou controle S2 usando reagente Trizol (Invitrogen), e o DNA contaminante foi removido pelo tratamento DNase I. A qualidade do RNA foi avaliada usando eletroforese capilar com um Bioanalisador 2100 (Agilent). O Poli(A)+ RNA foi extraído do RNA total usando contas magnéticas de oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). O kit de preparação de bibliotecas NEBNext Ultra II RNA (New England Biolabs) foi utilizado para a preparação de bibliotecas seguindo as instruções do fabricante. As bibliotecas de duas réplicas biológicas de células Lam-KD ou controle S2 foram quantificadas usando um fluorômetro Qubit e PCR quantitativa, e sequenciadas no Illumina NextSeq, resultando em 8,4-9,4 × 106 leituras de 80-nt de extremidade única. As leituras foram mapeadas para o genoma de referência D. melanogaster (versão dm3) usando o HISAT52 v2.1.0 com opção -max-intronlen 50.000. Leituras com baixa qualidade de mapeamento foram removidas usando SAMtools53 com a opção -q 30. Calculamos níveis de transcrição log2 em silos genômicos de 20 kb usando BEDtools54 v2.16.2 com opção -split, e então aplicamos a função hclust em R para agrupar os replicados usando o coeficiente de correlação 1-Spearman como uma métrica de distância. A expressão Gene foi quantificada com StringTie52 para a anotação de referência versão r5.12. Filtramos genes com expressão zero em mais de duas réplicas. Entre os 10.076 genes restantes, os genes diferentemente expressos foram definidos usando o pacote edgeR55 com média aparada dos valores M (TMM) de normalização em FDR = 0,05 cutoff. Os genes foram atribuídos aos LADs se seus TSSs estavam localizados dentro dos LADs, enquanto os genes foram atribuídos aos interLADs se seus TSSs estavam pelo menos 1kb distantes dos LADs. Uma pseudocontagem foi adicionada a todos os valores de expressão para se livrar de zeros. A pseudocontagem foi calculada como o valor mínimo na tabela de expressão gênica após a normalização. Em seguida, fizemos a média das réplicas e calculamos os valores log2(FC) entre Lam-KD e amostras de controle.

Real-time RT-qPCR para os genes selecionados aleatoriamente de diferentes LADs foi realizado em cDNAs sintetizados com primers de oligo(dT) no poli(A)+ RNA isolado a partir de 3 réplicas biológicas de células Lam-KD ou controle S2, usando a química EvaGreen (Jena Bioscience) e o hardware CFX96 (BioRad). Os níveis de expressão dos genes foram normalizados na expressão do gene act5C. Para RT-PCR semi-quantitativo, aplicado para a análise de genes do LAD 60D, a transcrição reversa do RNA foi realizada utilizando a transcriptase reversa SuperScript II (Invitrogen) na presença de primers aleatórios hexamer. A amplificação PCR de cDNAs foi realizada com a adição de 33P-dATP. As sondas após PCR foram separadas em PAAG 5%, que foi então fixada, seca e exposta à tela de armazenamento de fósforo (Amersham Biosciences). Os sinais foram escaneados com uma Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Para cada par de iniciadores o número de ciclos de PCR foi optimizado para se ajustar à fase exponencial de amplificação que foi controlada por uma diluição dupla de cDNA. Os níveis de expressão dos genes foram normalizados para a expressão omnipresente do gene CG4589. Seqüências de primers específicos de genes são apresentadas na Tabela Complementar 1.

ChIP-seq procedimento e análise de dados

ChIP-seq de duas réplicas biológicas de células controle e Lam-KD S2 com anticorpos anti-H3-pan acetilados (Active Motif, #39139) foi realizado como descrito anteriormente56, com algumas modificações. Após lavagem com PBS, ~2 × 107 células foram fixadas com 1,8% de formaldeído em PBS contendo 0,5 mM TDT durante 20 min à temperatura ambiente. A reticulação foi interrompida adicionando glicina a 225 mM durante 5 min e a lavagem em PBS contendo 0,5 mM TDT três vezes durante 5 min. As células foram lavadas uma vez no tampão A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoxicolato de sódio, 0,5 mM DTT, cocktail completo de inibidores de protease livre de EDTA (Roche)). As células foram lisadas no tampão A2 contendo 1% de SDS durante 10 min à temperatura ambiente, depois o lisado foi diluído 20 vezes pelo tampão A2 e incubado durante 2 min a 4 °C. Após a sonicação com VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulsos de 10 segundos com intervalos de 10 segundos a 15% de potência máxima) e 10 minutos de centrifugação em alta velocidade, a cromatina fragmentada (com o tamanho médio do fragmento de DNA ~0,5 kb) foi recuperada no sobrenadante. Para cada imunoprecipitação, ~10 μg de cromatina (~700 µl) foi pré-incubada na presença de 100 μl de Proteína A-Sepharose (PAS, 50% p/v, GE Healthcare) durante 1 h a 4 °C. A PAS foi removida por centrifugação, 5% da cromatina foi isolada como material “Input”, depois que 2 µl de anticorpos anti-H3-pan acetilados (Active Motif, #39139) foram adicionados à cromatina restante e as amostras foram incubadas durante a noite a 4 °C em uma roda giratória. Em seguida, 100 μl de PAS foram adicionados e a incubação continuou durante 4 h a 4 °C. As amostras foram centrifugadas na velocidade máxima durante 1 minuto e o sobrenadante foi descartado. As amostras foram lavadas quatro vezes no tampão A2 contendo 0,05% SDS e duas vezes em 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT tampão (cada lavagem durante 5 min a 4 °C). A cromatina foi eluída de PAS em 100 μl de 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8) a 65 °C durante 10 min, seguida de centrifugação e recuperação do sobrenadante. O material de PAS foi re-extraído em 150 μl de TE, 0,67% de SDS. Para inverter as ligações cruzadas, o eluato combinado (250 μl) foi incubado 6 h a 65 °C e tratado pela Proteinase K durante 3 h a 50 °C. As amostras foram extraídas de fenol-clorofórmio e isopropanol precipitado na presença de 20 μg glicogênio. O DNA foi dissolvido em 100 μl de água. Foram preparadas amostras de ChIP contendo ~25 ng de DNA precipitado, bem como amostras “Input” para a sequenciação da próxima geração utilizando um kit de preparação da biblioteca de DNA NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs). As bibliotecas foram sequenciadas no Illumina HiSeq 2000, resultando em leituras de 3,1-3,4 × 106 75-bp de extremidade única. As leituras foram mapeadas para o genoma de referência D. melanogaster (versão dm3) usando Bowtie 2 v2.2.1 (com a opção -muito sensível)57. Leituras com baixa qualidade de mapeamento foram removidas usando o SAMtools53 com a opção -q 30. Leituras duplicadas foram removidas usando o SAMtools rmdup. Calculamos log2 ChIP e sinais de entrada em silos genômicos de 1kb usando BEDtools54 v2.16.2, e depois aplicamos a função hclust em R para agrupar as réplicas usando o coeficiente de correlação de 1-Spearman como métrica de distância. As leituras foram atribuídas aos LADs se eles se sobrepusessem aos LADs, enquanto as leituras foram atribuídas aos interLADs se eles estivessem pelo menos a 1kb de distância dos LADs. Nós calculamos os números de leitura dentro de cada LAD e interLAD, normalizamos os valores para a soma da cobertura de leitura por réplica, excluímos LADs com cobertura zero e interLADs de análises posteriores, calculamos a média das réplicas, e calculamos os valores log2(FC) entre amostras Lam-KD e ChIP de controle.

Hi-C procedimento e análise de dados

Bibliotecas de Hi-C de duas réplicas biológicas independentes de células controle e Lam-KD S2 foram preparadas essencialmente como descrito anteriormente36 usando a enzima de restrição HindIII-HF (NEB). As bibliotecas foram sequenciadas na plataforma Illumina HiSeq 2000, resultando em 3-4 × 107 leituras em ponta de página. As leituras foram mapeadas para o genoma de referência D. melanogaster (versão dm3) usando Bowtie 2 v2.2.1 (com a opção -very-sensitive)57. Os dados Hi-C foram processados usando o pipeline ICE v0.9 (20 iterações de correção iterativa) como descrito58. Os mapas de interação Hi-C com resolução de 20kb foram obtidos. Os ATDs foram previstos utilizando o software Armatus59 v1.0, no qual o tamanho médio e o número de ATDs é determinado pelo parâmetro de escala γ. A anotação do ATD foi realizada em duas etapas, conforme descrito36. Primeiro, selecionamos manualmente o parâmetro γ para obter uma boa partição dos atados (γ = 1,20 para células Lam-KD e γ = 1,12 para células de controle). Em seguida, os DATs maiores que 600 kb foram divididos em DATs menores com o parâmetro de escala γ multiplicado por 2. Depois disso, os menores DATs (iguais ou menores que 60 kb) foram anotados como interTADs devido à sua estrutura interna mal resolvida. Como resultado, 576 (em controle) e 588 (em Lam-KD) Atendentes (TADs) foram revelados. Para examinar se as posições dos DATs são alteradas no Lam-KD, analisamos o grau de sobreposição de cada DAT nas réplicas fundidas de células de controle e Lam-KD com o das réplicas de controle ou nas réplicas de Lam-KD e não encontramos diferença estatisticamente significativa (P > 0,05 em um teste Wilcoxon de dois lados). O ACF dentro de cada DAT foi calculado como um valor médio dos números de leitura corrigidos iterativamente entre todos os silos genómicos pertencentes ao DAT, excluindo os silos limite de ambos os lados do DAT. O ACF dentro de cada DAT foi calculado como um valor médio dos números de leitura iterativamente corrigidos entre todos os contentores genómicos pertencentes aos contentores inter-TAD e os contentores limite dos DATs adjacentes. Para cada atendedor de chamadas, calculamos a razão entre o valor ACF em cada replicado Lam-KD e o valor ACF em cada replicado de controle (quatro razões no total). Para a análise a jusante foram utilizados DATs com pelo menos três relações do mesmo sinal. Observamos que quando selecionamos os DATs de acordo com critérios mais rigorosos (ou seja, todas as quatro razões foram alteradas no mesmo sentido), isso não afetou os resultados da análise (Figura Complementar 6). Os compartimentos cromatados foram anotados utilizando a análise dos componentes principais, conforme descrito17. Os gráficos de sela foram gerados conforme descrito58. Em resumo, utilizamos os mapas Hi-C observados/esperados, os quais foram calculados a partir de mapas de interação cis-interações corrigidos iterativamente de 20kb, dividindo cada diagonal de uma matriz pelo seu valor médio cromossômico. Em cada mapa observado/esperado, rearranjamos as linhas e as colunas na ordem crescente dos valores PC1 (que calculamos para as matrizes de controle). Finalmente, agregamos as linhas e as colunas da matriz resultante em 20 silos agregados de igual tamanho, obtendo assim um gráfico de compartimentação.

Análise dos dados publicados

Anotação do tipo cromatina para células S2 foi utilizada40. Foram calculadas as proporções dos tipos de cromatina em silos de 20 kb. A anotação dos DAE foi obtida a partir da ref. 28. Calculamos a proporção do comprimento do DDA em cada caixote de 20 kb de DDA.

Modelagem de polímeros

Utilizamos a Dissipative Particle Dynamics (DPD) para realizar simulações em computador, como descrito anteriormente36 com algumas modificações. Resumidamente, as macromoléculas são representadas em termos do modelo de grânulo e mola, com as partículas interagindo por uma força conservadora (repulsão), uma força dissipativa (atrito) e uma força aleatória (gerador de calor). Uma descrição detalhada da implementação desta técnica foi fornecida anteriormente60. O volume celular simulado foi de 50 × 50 × 50 unidades DPD, densidade igual a 3, portanto o número total de partículas no sistema é de 375.000. Assumimos que uma partícula corresponde a um nucleossoma. Além disso, introduzimos condições especiais de contorno, que são periódicas para o solvente e impermeáveis para outras partículas. A superfície é constituída por partículas imóveis, posicionadas hexagonalmente. Nas nossas simulações, as partículas imitam os tipos de nucleossomas “ativos” ou “inativos”, enquanto a superfície imita o NL. As partículas “inativas” podem criar ligações “saturantes” reversíveis61,62 umas com as outras, assim como com as partículas de uma superfície. Cada partícula “inativa” pode ter apenas uma ligação adicional por momento, o que simula uma interação de uma cauda com carga positiva de nucleosoma não acetilado com o “remendo ácido” de outro nucleosoma42,43,63. Nossa cadeia de copolímeros é representada por 64 blocos consistindo cada um em 500 partículas “inativas” e 50 partículas “ativas”. A probabilidade de criar uma associação entre duas partículas “inativas” foi definida para 0,001, entre a partícula “inativa” e a superfície – 0,007, enquanto a probabilidade de quebrar tal associação foi definida para 0,01. Durante as simulações, todas as partículas foram verificadas a cada 200 passos da DPD, quando o equilíbrio local foi obtido. Realizamos 10 execuções independentes no supercomputador MSU “Lomonosov-2” usando nossa própria implementação para o código DPD paralelizado de decomposição de domínio que está disponível no GitHub .

Análise estatística

Aplicamos o teste Wilcoxon para verificar se a distribuição dos valores de log2(FC) era simétrica em torno de zero, bem como para testar se duas distribuições de valores de log2(FC) diferiam por um deslocamento de localização de zero.

Resumo de relatórios

Outras informações sobre desenho experimental estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.