Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade do fluconazol contra 32 cepas clínicas de Candida albicans resistentes ao fluconazol, e C. albicans ATCC 10231, após sua exposição a concentrações subletais de óleo de árvore de chá (TTO) ou seu principal componente bioativo terpinen-4-ol. Para todas as cepas testadas de C. albicans resistentes a fluconazol TTO e terpinen-4-ol, as concentrações inibitórias mínimas (MICs) foram baixas, variando de 0,06% a 0,5%. A exposição de 24 horas das cepas de C. albicans resistentes ao fluconazol a fluconazol com dose subletal de TTO aumentou a atividade do fluconazol contra essas cepas. Em geral, 62,5% dos isolados foram classificados como suscetíveis, 25,0% exibiram susceptibilidade intermediária e 12,5% foram resistentes. Para todas as linhagens clínicas testadas, o fluconazol MIC diminuiu de uma média de 244,0 μg/mL para uma média de 38,46 μg/mL, e as concentrações fungicidas mínimas de fluconazol (MFC) diminuíram de uma média de 254,67 μg/mL para uma média de 66,62 μg/mL. O Terpinen-4-ol foi considerado mais ativo que o TTO, e aumentou fortemente a atividade do fluconazol contra as cepas de C. albicans resistentes ao fluconazol. Os resultados deste estudo demonstram que a combinação de substâncias naturais como o TTO e drogas convencionais como o fluconazol, pode ajudar a tratar infecções difíceis por leveduras.

1. Introdução

Os óleos essenciais são substâncias anti-sépticas produzidas pelas plantas. O óleo de árvore de chá (TTO) é o óleo essencial obtido por destilação a vapor da planta nativa australiana Melaleuca alternifolia e é usado medicinalmente como anti-séptico tópico. Possui um amplo espectro de atividade antimicrobiana contra uma ampla gama de bactérias, vírus e fungos, incluindo leveduras e dermatófitos. A TTO é uma mistura de mais de 100 compostos diferentes, principalmente terpenos (principalmente monoterpenos e sesquiterpenos). As propriedades físicas e a composição química da TTO são variáveis e, portanto, é importante determinar padrões internacionais. A Norma Australiana para o óleo de árvore de chá (AS 2782-1985) inclui directivas relativas aos níveis de dois componentes: o teor mínimo de terpinen-4-ol deve ser de pelo menos 30% e o teor máximo de 1,8-cineole deve ser inferior a 15% do volume de óleo . A norma internacional para o óleo de árvore de chá (ISO 4730:2004) inclui valores percentuais máximos e mínimos para os 15 componentes mais importantes da TTO. TTO obtido por destilação a vapor das folhas e ramos terminais da Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller, e outras espécies de Melaleuca devem estar em conformidade com esta norma .

TTO tem sido usado há séculos na medicina popular australiana, predominantemente para o tratamento de feridas . Na década de 1920, Penfold descreveu pela primeira vez as propriedades e composição química da TTO, e mais tarde confirmou as propriedades anti-sépticas da TTO e seus componentes . Na década de 1930, surgiram publicações consecutivas que demonstraram a poderosa actividade antimicrobiana da TTO quando usada em terapia inalatória, cirurgia asséptica, cirurgia dentária, desinfecção de feridas e enxaguamento da cavidade bucal .

Currentemente, a TTO é usada como agente local para tratar várias doenças, predominantemente dermatoses (por exemplo, herpes labial recorrente, acne, pústulas, caspa e erupção cutânea). A TTO é também usada para tratar infecções de Staphylococcus aureus da cavidade oral e faringe, vaginite e doenças do tracto respiratório. Numerosos estudos confirmaram a ampla atividade antimicrobiana da TTO contra bactérias, fungos e vírus, assim como microorganismos resistentes aos medicamentos convencionais. Isto é importante devido ao aumento de infecções de difícil tratamento, uma vez que a TTO pode ser usada como alternativa ou em combinação com medicamentos convencionais (incluindo antibióticos e quimioterápicos).

O tratamento de infecções pode ser baseado em monoterapia (usando um medicamento antimicrobiano) ou terapia combinada (dois ou mais medicamentos). O principal objectivo da terapia combinada é aumentar a acção dos fármacos, diminuindo simultaneamente as dosagens, através do sinergismo. Quando a monoterapia ou a terapia combinada baseada em medicamentos convencionais não tem sucesso, então o tratamento combinado incluindo um agente natural pode ser mais eficaz. Vários estudos recentes relataram o aumento da atividade antimicrobiana de substâncias naturais combinadas com drogas convencionais, em comparação com o tratamento com drogas convencionais isoladamente.

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade do fluconazol contra cepas clínicas de Candida albicans resistentes ao fluconazol e cepa de referência C. albicans ATCC 10231, após sua exposição a concentrações subletais de TTO ou seu principal componente bioativo terpinen-4-ol.

2. Materiais e Métodos

2.1. Candida albicans Estirpes

Este estudo incluiu 32 estirpes clínicas de Candida albicans, que foram isoladas dos seguintes materiais: esfregaços da faringe e cavidade oral (), vagina (), expectoração (), ou fezes (). Estas estirpes foram isoladas de cultura no ágar Sabouraud (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, França), e a identificação das espécies foi feita utilizando o teste bioquímico ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, França). Também utilizámos a estirpe de referência C. albicans ATCC 10231, que foi comprada à Oxoid Ltd. (Basingstoke, Grã-Bretanha). Nós previamente determinamos a sensibilidade das cepas de C. albicans ao fluconazol pelo teste de susceptibilidade de difusão em disco Kirby-Bauer usando discos de papel de filtro de 6 mm impregnados com 10 μg de fluconazol obtido de DHN (Cracóvia, Polônia) e ágar YNB (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5%, glicose 3%, ágar 1,8%, pH = 7) também obtido de DHN (Cracóvia, Polônia). As cepas de C. albicans foram classificadas como de suscetibilidade (diâmetro da zona de inibição de crescimento ≥18 mm), suscetibilidade intermediária (diâmetro da zona de inibição de crescimento de 14 mm a 17 mm), ou resistência (diâmetro da zona de inibição de crescimento <14 mm) ao fluconazol (os dados foram descritos no capítulo 3). Os valores de fluconazol MIC (concentração inibitória mínima) e MFC (concentração fungicida mínima) foram determinados pelo método de diluição do caldo de acordo com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI documento M27-A3-2008) . Usando este padrão, as cepas de C. albicans foram classificadas como de suscetibilidade exposta (MIC ≤ 8 μg/mL), suscetibilidade intermediária (MIC de 9 μg/mL a 63 μg/mL), ou resistência (MIC ≥ 64 μg/mL) ao fluconazol (os dados foram apresentados no capítulo 3).

2.2. Óleo de árvore de chá (TTO)

Neste estudo, usamos óleo de árvore de chá australiano (Melaleuca alternifolia) de Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Austrália) série 270930 que está em conformidade com a norma ISO 4730:2004 (Tabela 1). A TTO foi destilada de folhas de Melaleuca alternifolia especialmente selecionadas, uma planta nativa das regiões costeiras do norte de Nova Gales do Sul e sudeste de Queensland na Austrália. A análise da composição da TTO foi realizada por cromatografia de gás de acordo com a norma internacional ISO 4730. Foi realizada nas seguintes condições: coluna de sílica fundida (50 m × 0,20 mm i.d.), espessura do filme 0,25 μm) e tipo de ionização de chama do detector, o gás de transporte era hidrogênio (vazão de 1 mL/min), o programa de temperatura do forno era de 70°C a 220°C a uma taxa de 2°C/min, a temperatura do injetor era 230°C, a temperatura do detector era 250°C, o volume de TTO injetado era 0,2 μL, e a razão de divisão era 1 : 100.

Em nosso estudo, também utilizamos terpinen-4-ol, que foi obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

2.3. Fluconazol

Neste estudo, utilizamos o medicamento antifúngico fluconazol (Polfarmex, Kutno, Polônia). A estrutura da molécula de fluconazol é mostrada na Figura 1.

Figura 1

>Estrutura química do fluconazol .

2.4. Preparação do Candida albicans inicial Suspensão

C. células albicans cultivadas durante 24 h em ágar Sabouraud foram suspensas em solução salina (0,85% NaCl) e ajustadas a um padrão de densidade 0,5 McFarland (1,5 × 108 CFU/mL). Esta suspensão foi posteriormente diluída a uma densidade de 6 × 104 UFC/mL. A suspensão foi então usada para estimar os valores MIC e MFC para TTO, terpinen-4-ol, e fluconazol.

2,5. Determinação dos valores MIC e MFC para TTO e Terpinen-4-ol

A atividade da TTO contra as cepas de C. albicans testadas foi determinada pela macrodiluição do caldo usando os padrões gerais de diluição como descrito pela PN-EN ISO 20776-1:2007 . A TTO foi serialmente diluída em meio líquido Sabouraud com 10% de Tween 80 a concentrações finais de TTO de 1% a 0,0075%. O detergente Tween 80 ajuda a dissolver a TTO. O mesmo volume da suspensão de C. albicans foi adicionado a cada tubo para obter uma densidade final de 3 × 103 CFU/mL. Após 24 h de incubação a 35°C, o crescimento celular foi avaliado visualmente nos tubos com TTO e no tubo de controle positivo (sem TTO). O MIC foi definido como a menor concentração de TTO que não levou a nenhum crescimento visível das estirpes celulares testadas. O valor do MFC foi definido como a menor concentração de TTO que não mostrou crescimento das colônias de C. albicans. O experimento foi realizado triplamente. Os valores MIC e MFC de terpinen-4-ol foram determinados de forma idêntica como descrito acima. A TTO e terpinen-4-ol MICs foram usados para calcular as doses subletais de TTO e terpinen-4-ol usadas nos seguintes experimentos.

2,6. Breve pré-tratamento de Candida albicans com 1/4 MIC TTO

Para cada amostra, foi preparado um tubo contendo solução salina com 10% Tween 80 e TTO para uma concentração final de 1/4 MIC TTO. Também foi preparado um tubo de controle sem TTO. Em seguida, a suspensão de C. albicans foi adicionada aos tubos para obter uma densidade final de 3 × 103 CFU/mL. As suspensões foram então incubadas a 35°C durante 30 minutos. As amostras foram então lavadas duas vezes e centrifugadas entre lavagens (3000 ×g, 15 minutos), e as células foram ressuspendidas a uma densidade de 6 × 104 UFC/mL. A suspensão foi então utilizada para determinar a MIC do fluconazol e a concentração fungicida mínima (MFC) do fluconazol. O estudo foi realizado em triplicata.

2,7. Determinação dos Valores de Fluconazol MIC e MFC após Breve Pré-Tratamento de Candida albicans com 1/4 MIC TTO

A atividade do fluconazol contra as cepas de C. albicans testadas foi determinada pela macrodiluição do caldo usando os padrões gerais de diluição como descrito pelo PN-EN ISO 20776-1:2007 . Diluições seriais e paralelas do fluconazol variando de 256,0 μg/mL a 0,125 μg/mL foram preparadas em meio líquido Sabouraud, e um tubo de controle sem a droga foi incluído. Para cada um dos tubos, foi adicionado o mesmo volume de suspensão de células de C. albicans pré-tratadas com 1/4 MIC TTO, e o inóculo foi ajustado para uma densidade final de 3 × 103 UFC/mL. Após 24 h de incubação a 35°C, o crescimento celular em cada tubo foi avaliado visualmente. O valor de MIC foi definido como a menor concentração de fluconazol que não resultou em crescimento visível das cepas testadas. As células do tubo identificadas como MIC, assim como várias das diluições circundantes, foram plaqueadas ao ágar Sabouraud. Após 24 h de incubação a 35°C, as colônias de C. albicans foram contadas. O valor de MFC foi definido como a menor concentração de fluconazol que não mostrou crescimento das colônias de C. albicans. O experimento foi realizado em triplicata. As cepas de C. albicans foram classificadas como exibindo susceptibilidade, susceptibilidade intermediária ou resistência ao fluconazol de acordo com o documento CLSI M27-A3-2008 , como descrito na Seção 2.1.

2.8. Pré-tratamento prolongado de Candida albicans com Fluconazol e Dose Subletal de TTO ou Terpinen-4-ol

Série, diluições paralelas de fluconazol variando de 256,0 μg/mL a 0,125 μg/mL foram preparadas em meio de cultura líquido Sabouraud. Dois controles positivos foram incluídos. Todos os tubos continham 10% de Tween 80, e foi adicionado TTO a cada diluição e um dos tubos de controle para alcançar uma concentração final de 1/4 MIC TTO. O segundo tubo de controle continha apenas o meio líquido. Em seguida, um volume igual de suspensão de C. albicans foi adicionado a cada tubo até uma densidade final de 3 × 103 UFC/mL. Todos os tubos foram incubados a 35°C durante 24 h. Após a incubação, o crescimento celular em cada tubo foi avaliado visualmente, e os valores de MIC e MFC de fluconazol foram definidos, como descrito anteriormente. As células do tubo identificadas como MIC, bem como várias das diluições ao redor, foram plaqueadas ao ágar Sabouraud. Após 24 h de incubação a 35°C, as colônias de C. albicans foram contadas, e o valor de MFC do fluconazol foi definido. O experimento foi realizado em triplicata. O pré-tratamento prolongado de C. albicans com fluconazol e terpina-4-ol foi realizado de forma idêntica como descrito acima.

2,9. Métodos estatísticos

Os resultados são apresentados como a média aritmética e a mediana. As diferenças estatísticas entre os valores médios foram determinadas pelo teste de Student e pelo teste de Mann-Whitney, dependendo de quão bem os resultados se correlacionavam com uma distribuição normal. Os valores de foram considerados estatisticamente significativos. O programa STATISTICA versão 10 (StatSoft, Cracóvia, Polônia) foi usado para realizar as análises estatísticas.

3. Resultados

As cepas de Candida albicans testadas foram resistentes ao fluconazol e suscetíveis a baixas concentrações de TTO. As cepas clínicas de C. albicans e C. albicans ATCC 10231 de referência, testadas pelo teste de susceptibilidade de difusão em disco de Kirby-Bauer, não exibiram a zona de inibição de crescimento. Todas as cepas de C. albicans estudadas foram classificadas como exibindo resistência ao fluconazol. Os valores de MIC de fluconazol para as 32 cepas clínicas de C. albicans variaram de 64,0 μg/mL a 256,0 μg/mL (média = 244,0 ± 47,22 μg/mL). Os valores mais comuns foram 256,0 μg/mL (30 cepas) e 64,0 μg/mL (2 cepas). Para C. albicans ATCC 10231 a cepa de referência do fluconazol MIC foi 256,0 μg/mL.

As TTO MICs para as 32 cepas clínicas de C. albicans variaram de 0,06% a 0,5% (média = 0,19 ± 0,09%). Os valores mais comuns foram 0,125% (15 cepas) e 0,25% (15 cepas). As TTO MIC das duas cepas restantes foram de 0,06% e 0,5%. Para C. albicans ATCC 10231 estirpe de referência, a TTO MIC foi de 0,125%. Estes resultados indicam que as cepas de C. albicans testadas não demonstraram qualquer resistência cruzada à TTO e fluconazol. Os valores da TTO MIC foram usados para calcular as doses subletais (1/4 MIC TTO) usadas no resto do estudo.

O breve pré-tratamento de 32 cepas clínicas de C. albicans e de C. albicans ATCC 10231 de referência com 1/4 MIC TTO não alterou os valores de fluconazol MIC e MFC. A exposição das cepas de C. albicans a 1/4 MIC TTO e fluconazol durante 24 horas (pré-tratamento prolongado) aumentou significativamente a susceptibilidade das cepas de levedura ao fluconazol. Das 32 cepas clínicas de C. albicans resistentes ao fluconazol, 28 cepas (87,5%) exibiram então suscetibilidade elevada ou intermédia ao fluconazol (Tabela 2).

Exposição de estirpes de Candida albicans resistentes ao fluconazol durante 24 h a 1/4 MIC TTO e actividade fluconazol melhorada de fluconazol contra estas estirpes. Em geral, 62,5% dos isolados foram classificados como suscetíveis, 25,0% exibiram susceptibilidade intermediária e 12,5% foram resistentes. Para todas as cepas clínicas testadas, a média de fluconazol MIC diminuiu de 244,0 μg/mL para 38,46 μg/mL após este pré-tratamento prolongado, e a média de fluconazol MFC diminuiu de 254,67 μg/mL para 66,62 μg/mL (Tabela 3). Os valores de MIC e MFC para as cepas susceptíveis () e com susceptibilidade intermediária () foram estatisticamente baixos em comparação com os valores análogos obtidos para a amostra controle e para as amostras que foram apenas brevemente pré-tratadas com TTO. Para o grupo de isolados suscetíveis, o fluconazol MIC diminuiu para uma média de 0,52 μg/mL, e o fluconazol MFC diminuiu para uma média de 4,25 μg/mL. O pré-tratamento prolongado de Candida albicans ATCC 10231 padrão com 1/4 MIC TTO e fluconazol não aumentou a susceptibilidade desta estirpe ao fluconazol, como as quatro estirpes clínicas de C. albicans resistentes ao fluconazol estudadas.

Terpinen-4-ol, o principal componente bioactivo presente na TTO, aumenta fortemente a actividade do fluconazol contra estirpes de C. albicans resistentes ao fluconazol. Os MICs de terpinen-4-ol para cepas clínicas de C. albicans variaram de 0,06% a 0,25% (média = 0,11 ± 0,09%). Para a estirpe ATCC 10231 de C. albicans, a MIC de terpinen-4-ol foi de 0,06%. As cepas de C. albicans testadas não apresentaram resistência cruzada ao terpinen-4-ol e fluconazol. A exposição das cepas de C. albicans resistentes ao fluconazol e C. albicans padrão por 24 h a fluconazol e doses subletais (1/4 MIC) de terpinen-4-ol aumentou fortemente a atividade de fluconazol contra essas cepas, e todos os isolados de C. albicans foram classificados como suscetíveis (fluconazol MIC diminuiu para 0,125 μg/mL). Resumimos os resultados deste estudo, e os dados mais importantes são apresentados em forma de tabela (Tabela 4).