Resultados

LFS Induz a Depressão a Curto Prazo na Região CA1 de Ratos em Movimento Livre. Sabe-se que o grau de LTD provocado pelo LFS depende da deformação dos ratos (20). A cepa de rato utilizada neste estudo, Harlan Winkelmann Wistar, mostrou consistentemente uma depressão de transmissão sináptica após LFS a 1 Hz, que suportou por ≈45 min (Fig. 1; n = 16, P < 0,001).

Exploração de uma placa de furo contendo objetos durante o LFS Induz um LTD robusto. Pelo menos 8 dias após os experimentos LFS de controle, o efeito da exposição de novidade nas respostas solicitadas por LFS foi examinado. Experimentos anteriores mostraram que ratos Hooded Lister expressam LTD quando o LFS é dado simultaneamente com a exposição à novidade (17, 20). Repetimos este protocolo usando ratos Harlan Winkelmann Wistar. Os animais foram autorizados a explorar uma tábua de perfuração com quatro objetos diferentes durante o LFS (Fig. 2, n = 10). A inserção da tábua de furos causou um melhor comportamento exploratório, e em apenas um caso foram observados sinais de estresse, ou seja, comportamento de congelamento. Este rato foi excluído da análise dos dados. A exploração da tábua de perfuração contendo objetos converteu uma depressão de curto prazo em um LTD que durou pelo menos 25 h. As diferenças individuais de pontos de tempo foram avaliadas pela análise de teste t de IFT dada isoladamente e IFT dada concomitantemente com a exposição da tábua de furos. Isto revelou uma depressão significativamente melhorada no grupo da placa de furos de t = 15 min (P < 0,05).

Para investigar se o efeito facilitador da exploração da novidade sobre o LTD foi realmente devido à aquisição da novidade e não a um efeito não-mnemônico como o aumento da atividade locomotora (que poderia provocar mudanças na magnitude dos potenciais relacionados à temperatura do cérebro) (21), nós subsequentemente reexpusemos os animais para a mesma tábua de perfuração com a mesma constelação de objetos após o LTD ter retornado aos níveis pré-LFS (Fig. 2, reexposição; n = 5). A exposição a uma tábua de furos agora familiar durante a aplicação de IFT não mais provocou o LTD. No entanto, ocorreu uma depressão transitória, que diminuiu mais rapidamente do que após a aplicação de IFT em experimentos de controle (t = 45 min; P < 0,05, teste t; n = 5). De t = 60 min, houve uma diferença significativa que ocorreu entre a primeira exposição e a reexposição à placa de perfuração (P < 0,0019, teste t). A ANOVA revelou um efeito de habituação altamente significativo para a tábua de perfuração .

A hipótese subjacente a este estudo é que o LTD se correlaciona com uma parte específica da aquisição de novidade, como a detecção da localização do objeto dentro do espaço, em oposição à exploração do espaço alocêntrico ou reconhecimento do objeto. Para testar se isto é verdade, submetemos os ratos a uma nova experiência. A mesma placa de furos foi inserida na câmara de gravação, mas os objectos foram agora posicionados aleatoriamente numa constelação de furos que diferia da constelação anterior. Assim, nesta ocasião, a única variável nova era a localização diferente dos objetos; a familiarização com a placa de furos já havia ocorrido (Fig. 2, nova configuração dos objetos). Com esta configuração, intrigantemente, o LTD foi mais uma vez induzido . Os valores de inclinação do campo EPSP (fEPSP) 5 min após o LFS foram 49,0% ± 3,5%, significativamente inferiores aos valores observados após a primeira exposição à placa de furos (P < 0,05, teste t). Assim, a indução de LTD provocada pela exposição a uma nova constelação espacial de objetos familiares foi mais forte do que a provocada por uma nova constelação de objetos novos. Nenhuma outra diferença no perfil de LTD foi notada, entretanto, e a manutenção de LTD não foi alterada. Estes achados indicam fortemente que LTD está associado ao mapeamento espacial de objetos e não à exploração espacial per se.

Spatial Exploration Is Not Sufficient to Trigger LTD (Exploração espacial não é suficiente para acionar LTD). A questão seguinte que abordamos foi se a exploração dos objetos foi o único contribuinte para o LTD observado. Para explorar isso, nós designamos o restante de nossos animais para uma nova exploração da tábua de perfuração na ausência de objetos. Assim, pudemos examinar o efeito que a nova aquisição de um ambiente desconhecido (ou seja, a tábua de perfuração) tem sobre o LTD, sem nenhum efeito de mascaramento da exploração do objeto e sua configuração espacial. Quando a LFS foi aplicada durante a presença da placa de furo vazia, resultou em um nível de depressão comprometido (Fig. 3a , n = 6); houve significativamente menos depressão quando a placa de furo vazia estava presente durante a LFS, como observado no experimento de controle da LFS. Assim, a exploração da placa vazia inibiu a indução da depressão de curto prazo (três primeiras gravações após a IFT, P < 0,01). Neste caso, não só o LFS foi insuficiente para a indução de LTD, como a exploração da nova placa de furos também neutralizou o efeito do LFS. Na experiência seguinte, o mesmo grupo de animais foi exposto ao agora familiar holeboard, mas desta vez na presença de objetos (Fig. 3, holeboard com objetos, n = 6). Sob estas condições, o LFS facilitou a indução do LTD . O LTD obtido não diferiu significativamente daquele observado quando os ratos foram autorizados a explorar uma tábua de perfuração desconhecida com objetos novos pela primeira vez. Isto implica que a habituação à tábua de furos sozinha não afetou a indução de LTD e ainda suporta a probabilidade de LTD estar associada à exploração de novos itens.

Exploração Espacial mas Não Exploração de Objectos Facilita o LTP. Ficamos intrigados com o efeito aparentemente inibitório que a exploração espacial teve na indução do LTP. Para examinar melhor este efeito, repetimos o experimento acima com um novo conjunto de animais, mas ao invés do LFS agora demos um HFT fraco (100 pulsos a 100 Hz), que em condições normais produziu uma potencialização de curto prazo (Fig. 4a ). HFT foi aplicado imediatamente após a introdução dos ratos na tábua de perfuração (ou seja, t = 0 min); os animais foram autorizados a explorar a tábua de perfuração por 15 min para torná-la comparável com o experimento LFS correspondente. A exposição à tábua de perfuração facilitou significativamente o LTP (n = 9) em comparação com os controles (n = 9) . Vinte e quatro horas depois, nenhuma potência era evidente nos animais que não tinham sido expostos à tábua de perfuração. Entretanto, os valores de fEPSP ainda eram potenciados em animais expostos à tábua de furos (P < 0,01, teste t). Assim, o efeito inibidor da exploração espacial sobre o LTD, que observamos, pode estar correlacionado a uma mudança para uma maior suscetibilidade para LTP.

Se a exploração de um novo ambiente e a exploração de tacos dentro desse ambiente depender de mudanças opostas na força sináptica, pode-se levantar a hipótese de que o limiar de indução de LTP é elevado durante a exploração de objetos novos. Investigamos esta possibilidade dando um forte HFT (4 trens de 30 pulsos a 100 Hz, em intervalos de 5 minutos entre trens) durante a exploração da placa de perfuração (Fig. 5a ). O tétano induziu o LTP nos ratos sob condições de controle. Quando a placa de furo estava presente, resultou em uma depotenciação do LTP. Curiosamente, isto não aconteceu imediatamente. Nos primeiros 10 minutos após a remoção da tábua de perfuração, não houve diferença significativa entre as respostas HFT de controle e as respostas HFT sob exploração da tábua de perfuração. Os fEPSPs foram inicialmente potenciados para 146,7% ± 13,8% do valor basal sem placa de furo (n = 9) e 123,0% ± 9,7% com exploração com placa de furo (5 min após HFT, n = 6). Quando os ratos foram expostos à tábua de perfuração, uma rápida depotenciação ocorreu 15 min após HFT (P < 0,001, teste t). Essa depotenciação foi de longa duração, e 24 h após o HFT o valor foi de 100,5% ± 5,7%. A ANOVA revelou um efeito significativo da exploração da placa de perfuração no LTP induzido pelo HFT .

Se a depotenciação observada compartilhar propriedades mecanicistas com LTD induzida por objeto, poderia ser esperado que a LFS aplicada após a depotenciação não causaria depressão sináptica adicional. Nós aplicamos LFS2 h após a depotenciação ter sido induzida pela exploração de tábua de perfuração em animais HFT. Este ponto de tempo para aplicação da IFT foi escolhido porque havia uma estabilização da depotenciação naquele momento (n = 5). Nenhum LTD significativo foi induzido pelo LFS sob estas condições, sugerindo que mecanismos comuns são compartilhados pelo LTD e a depotenciação induzida pela exposição das tábuas de perfuração.

LTD Induzido pela Exploração de Objetos é Modulado por Receptores 5-HT4. A ativação dos receptores 5-HT4 tem um efeito inibitório no LTD induzido eletricamente (dados não publicados). Além disso, um papel para o receptor 5-HT4 tem sido descrito para múltiplas funções cognitivas no cérebro (22-25). Assim, a ativação dos receptores de 5-HT4 também pode prejudicar a aprendizagem de associações objeto-lugar. Um grupo de ratos (n = 5) recebeu uma injeção intracerebral de 5 μl de RS67333 (2 μg/μl), um agonista seletivo de 5-HT4, 30 min antes de serem introduzidos na placa de furos contendo o objeto. Um grupo de controle (n = 5) recebeu a mesma quantidade de soro fisiológico. A ativação dos receptores 5-HT4 bloqueou completamente a expressão de LTD induzida pela exploração (Fig. 6a ) .

Os animais foram então testados para LTD durante a reexposição à tábua de perfuração (pelo menos 7 dias após a primeira exposição). Antes da reexposição à tábua de perfuração, todos os animais foram injetados com soro fisiológico para imitar as condições da experiência anterior. Enquanto os animais que haviam recebido apenas injeções veiculares (antes da primeira exposição e reexposição) não mostraram nenhuma facilitação do LTD semelhante aos efeitos descritos na Fig. 2, o grupo que havia recebido RS67333 antes da primeira exposição mostrou um LTD significativo. De acordo com nosso postulado de que o LTD codifica informações novas, a inibição do LTD pelo RS67333 pode ter prejudicado a codificação das associações objeto-lugar. Assim, quando reexpusemos os animais tratados por RS67333 para a tábua de perfuração com a mesma constelação de objetos que anteriormente, isso efetivamente compreendeu uma nova experiência, e assim a facilitação do LTD ocorreu.

Para obter uma medida de habituação e confirmação adicional dessa possibilidade, fizemos um experimento comportamental semelhante em uma tábua de perfuração de campo aberto (80 × 80 × 80 cm). O número de recuos e mergulhos de cabeça nos furos é uma expressão da atividade exploratória. Se a habituação ocorrer, pode ser esperado que a reexposição conduza a um número significativamente menor de rears e head-dippings. Dois grupos de oito ratos foram injetados cegamente com 10 μg de RS67333 ou soro fisiológico 30 min antes do primeiro ensaio. Dois ensaios, cada um com duração de 15 min, ocorreram 24 h separados. O grupo controle fez significativamente menos imersão e recriação da cabeça quando reexposto para a tábua de perfuração em relação ao seu desempenho no primeiro ensaio (teste t, P < 0,05, ambos parâmetros, dentro do grupo). Isto significa que os animais de controle foram capazes de lembrar o ambiente 24 h após seu primeiro encontro com a caixa. No entanto, o grupo da droga não mostrou nenhum efeito de habituação significativo para a tábua de furos (Fig. 6b ). Assim, enquanto a habituação normalmente ocorre após 15 min de exploração da caixa de campo aberto, a ativação dos receptores 5-HT4 inibiu este fenômeno.