Estirpes bacterianas e condições de crescimento

Estirpes bacterianas estão listadas na Tabela Complementar 2. As Escherichia coli foram cultivadas em placas de Caldo de Luria (LB) ou em meio líquido LB, suplementadas com 200 µg ml-1 de eritromicina a 37 °C. A transformação de E. coli com DNA plasmídeo foi realizada utilizando células quimicamente competentes. S. pneumoniae serótipo 2 D39 e serótipo 4 TIGR4 e seus mutantes isogênicos foram cultivados em placas de ágar sangue Columbia (Oxoid) contendo eritromicina (5 µg ml-1) e/ou cloranfenicol (5 µg ml-1), ou cultivados em caldo de Todd-Hewitt suplementado com extrato de levedura 0,5% (THY; Roth) ou meio quimicamente definido (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences), respectivamente. O cultivo de pneumococos em ágar sangue ou em culturas líquidas foi realizado a 37 °C e 5% CO2 sem agitação.

Construção do mutante

Para a construção dos mutantes pneumocócicos tacL em D39 e TIGR4, um fragmento de DNA composto pelo S. pneumoniae D39 spd_1672 e suas regiões de flanking up- and down-stream foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico usando o primer SPD1672_OLup_for e SPD1672_OLdwn_rev (os primers estão listados na Tabela Complementar 2). Os produtos de PCR purificados foram clonados em pUC18 e E. coli DH5α as células quimicamente competentes foram transformadas com o plasmídeo resultante. O plasmídeo recombinante pNH1 que abriga o inserido de ADN desejado foi purificado e utilizado como modelo para uma reacção PCR inversa com os iniciadores InvrevKpnISPD1672 e InvforPstISPD1672. A sequência genética eliminada foi substituída por um gene ermB, amplificado por PCR a partir do vector pTP1 usando o primer InvrevKpnIErm e InforPstIErm. O plasmídeo recombinante final foi usado para transformar e mutagenizar pneumococos. A eficiência da transformação foi avaliada usando o plasmídeo recombinante final vs. outro plasmídeo para deleção do gene cbpL (para deleção do gene cbpL) em S. pneumoniae D39Δcps 44. Notavelmente, a eficiência de transformação foi assim significativamente aumentada para a deleção tacL (2,8 colônias por ng plasmídeo para cbpL vs. 29,8 colônias por ng plasmídeo para tacL).

Os mutantes isogênicos foram complementados por um pBAV1CpE baseado em sistema trans; pBAV1CpE foi modificado a partir do pBAV1K-T5-gfp45, trocando o gene de resistência à canamicina por um gene de resistência ao cloranfenicol e o promotor T5 por uma região promotora de eritromicina (pE), que inclui o local de ligação ribossômica e o códon inicial. O gene completo spd_1672 foi amplificado por PCR usando o primer 1672_com_for e Spd1672_com_rev e o fragmento purificado foi clonado em pBAV1CpE. O plasmídeo resultante pBAV-tacL foi utilizado para transformar mutantes isogênicos tacL. A eliminação do tacL, bem como a complementação em trans foram verificadas utilizando o qRT-PCR (Fig. 3 Suplementar).

PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Cepa D39 não encapsulada e não encapsulada do tipo selvagem, mutante tacL-deficiente, e mutante complementado foram cultivados em THY até a fase de meio-log (A 600 = 0,35-0,45) e colhidos para isolamento do RNA usando o kit de purificação do RNA universal EURx GeneMatrix (roboklon). A qualidade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose e PCR padrão usando primer EnoRT_F e EnoRT_R (ver Tabela Complementar 2). A síntese do cDNA foi realizada utilizando o SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) e primers hexamericanos (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade do cDNA foi controlada por PCR usando os primers EnoRT_F e EnoRT_R e a concentração foi medida por nanodrop. O cDNA foi armazenado a -20 °C até a realização de outros testes. Para os ensaios qRT-PCR, o Sistema de PCR em Tempo Real StepOnePlusTM (Applied Biosystems) e SYBR® Green Master Mix (Biorad) foram usados em combinação com iniciadores específicos de tacL, bem como iniciadores de enolase-primers como controlo (ver Tabela Complementar 2). O software StepOne (v. 2.3, Life Technologies) foi utilizado para a análise de dados. Os resultados finais são apresentados como magnitude de fluorescência (ΔRn) traçada contra os números do ciclo de PCR.

Sequenciamento e análise bioinformática

Sequenciamento: 1 ng de ADN cromossómico purificado de S. estirpes de pneumoniae D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), e TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) foi usado para preparar bibliotecas individuais empregando e seguindo o Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Um Bioanalisador da Tecnologia Agilent 2100 serviu para verificar a tagmentation e a distribuição final do tamanho do fragmento da biblioteca em um chip de DNA de alta sensibilidade. As contas AMPure XP foram utilizadas para purificação da biblioteca de ADN. A biblioteca final foi aplicada a um kit MiSeq Reagent v3 600cycle e sequenciada em um sistema MiSeq como 300 ciclos de execução de ponta de tela. O pool final da biblioteca foi colocado com 5% da biblioteca de controle PhiX. Uma densidade de cluster de 847 ± 25 (K mm-2) foi alcançada com 96,46 ± 1,48% dos clusters passando as especificações do filtro. 20,3 milhões de leituras (94,7%) de 21,1 milhões de leituras totais passaram pelas especificações do filtro, levando a 12,52 Gbp de dados de seqüência. As leituras de índice foram distribuídas uniformemente entre as seis amostras individuais. Os arquivos FASTQ gerados foram submetidos a análises bioinformáticas adicionais conforme descrito abaixo.

Detecção e anotação do SNP: A detecção de SNP foi feita para S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individualmente usando “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parâmetro: porção mínima para evidência de variantes: 60%; cobertura mínima do site da variante: ≥5 seqüências lidas). Como genoma de referência foi utilizado Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) ou Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

Os SNPs resultantes para cada grupo de mutantes (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) e (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) foram fundidos e comparados. A cobertura do genoma foi estimada com qualimap46 usando os mesmos genomas de referência para a detecção de SNP.

Isolamento dos ácidos teicóicos pneumocócicos

Extracção e Isolamento da LTA: A purificação da LTA foi realizada basicamente como descrito em outra parte7, mas para optimizar o rendimento da pnLTA, um detalhe específico foi modificado. As células pneumocócicas foram ressuspendidas em tampão citrato (50 mM, pH 4,7) e perturbadas três vezes pela prensa francesa (Sistema de Perturbação Célula Constante, Número de Série 1020) a 10 °C a uma pressão de 20 kPSI. O SDS foi adicionado a uma concentração final de 4% aos sobrenadantes combinados. A solução foi incubada durante 30 min a 100 °C e depois agitada durante a noite à temperatura ambiente. A solução foi centrifugada a 30.000×g durante 15 min. a 4 °C. O pellet foi lavado quatro vezes com tampão citrato utilizando as condições de centrifugação acima referidas. Os sobrenadantes combinados contendo LTA e o sedimento resultante, contendo o complexo PGN-WTA bruto, foram liofilizados separadamente. Os sólidos resultantes foram ambos lavados cinco vezes com etanol (centrifugação: 20 min, 20 °C, 10.650×g) para remover SDS e liofilizados (levando ao sedimento A contendo LTA e o sedimento B contendo o complexo PGN-WTA). Para isolamento de LTA, a pelete A foi ressuspendida em tampão citrato e extraída com um volume igual de butan-1-ol (Merck) à temperatura ambiente sob agitação vigorosa. As fases foram separadas por centrifugação a 2.100×g durante 15 minutos a 4 °C. A fase aquosa (contendo LTA) foi coletada, e o procedimento de extração foi repetido duas vezes com a fase orgânica mais a interfase. As fases aquosas combinadas foram liofilizadas e posteriormente dialisadas por 5 dias a 4 °C contra 50 mM de tampão de acetato de amônio (pH 4,7; membrana de corte de 3,5 kDa); o tampão foi trocado a cada 24 h. O LTA bruto resultante foi purificado por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) realizada em uma coluna HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare; 16 × 100 mm, volume de leito 20 ml). O material bruto da LTA foi dissolvido no mínimo tampão de partida (15% propan-1-ol (Roth) em acetato de amônio 0,1 M (pH 4,7)) e centrifugado a 13.000×g durante 5 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante resultante foi liofilizado. O sedimento contendo LTA foi dissolvido no tampão inicial HIC a uma concentração de 30 mg ml-1 e purificado pelo HIC usando um gradiente linear de 15 a 60% propan-1-ol (Roth) em acetato de amônio 0,1 M (pH 4,7). Frações contendo LTA foram identificadas por um teste fotométrico de fosfato47. As frações contendo fosfato foram combinadas, liofilizadas e lavadas com água na liofilização para remover o tampão residual.

Extração e isolamento do WTA: o isolamento e a extração do WTA foram realizados conforme descrito em outra parte11, mas com pequenas modificações. Pellet B (contendo o complexo PGN-WTA bruto), que surgiu durante o isolamento LTA, foi ressuspenso a uma concentração de 10 mg ml-1 em 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) contendo 20 mM MgSO4. DNase A e RNase I foram adicionados a concentrações finais de 10 e 50 µg ml-1, respectivamente. A suspensão foi agitada durante 2 h a 37 °C. Subsequentemente, 10 mM CaCl2 e trypsin (100 µg ml-1) foram adicionados e a agitação foi continuada durante a noite a 37 °C. SDS a uma concentração final de 1% foi adicionado, e a mistura foi incubada por 15 min a 80 °C para inativar as enzimas. A parede celular foi recuperada por centrifugação durante 45 min a 130.000×g a 25 °C. O sedimento resultante foi ressuspenso em 0,8 ml de LiCl 8 M por 1 ml inicialmente utilizado solução de Tris-HCl e incubado por 15 min a 37 °C. Após outra centrifugação utilizando as mesmas condições acima, o sedimento foi ressuspenso em 1 ml de ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA, pH 7,0) por ml da solução de Tris-HCl utilizada inicialmente e esta amostra foi incubada a 37 °C durante 15 min. O pellet foi lavado duas vezes com água. Finalmente, o sedimento foi ressuspenso em 2-4 ml de água e liofilizado, produzindo o complexo PGN-WTA purificado. Dependendo da questão específica da pesquisa, outros tratamentos químicos ou enzimáticos foram realizados posteriormente.

Tratamentos químicos e enzimáticos

Tratamento com hidrazina da LTA: A LTA purificada foi dissolvida a uma concentração de 5 µg µl-1 em hidrazina anidra (N2H4; ICN Biomedicals) antes da incubação durante 1 h a 37 °C enquanto era agitada. A reação foi atenuada pela adição do mesmo volume de acetona e seca sob uma corrente de nitrogênio; a etapa de secagem foi repetida duas vezes. Posteriormente, a LTA desacylada bruta foi purificada por cromatografia de permeação em gel (GPC) num Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; tamanho da coluna: 1,5 × 120 cm; tampão: 150 mM de acetato de amônio (pH 4,7)) coluna.

Digestão enzimática do complexo PGN-WTA: Para remover todos os aminoácidos do PGN, o complexo PGN-WTA foi dissolvido em 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) e tratado com o LytA pneumococócico em meio a uma enzima como descrito em outra parte11. O LytA com a marca Recombinant His-tagged (10 µg LytA por mg) foi adicionado em três alíquotas após 0, 24 e 48 h para um período total de incubação de 72 h a 37 °C. Subsequentemente, a enzima foi inactivada por fervura durante 5 min a 100 °C. Após a centrifugação (25.000×g, 15 min, 20 °C), o sobrenadante foi coletado e liofilizado. O complexo PGN-WTA cru tratado com LytA foi purificado por GPC num Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; tamanho da coluna: 1,5 × 120 cm; tampão: 150 mM de acetato de amónio (pH 4,7)). O material de alto peso molecular obtido (~12 mg) foi posteriormente digerido com lisozima (200 µg; Sigma) e mutanolisina (200 µg; Sigma) em uma mistura de reação de 800 µl contendo fosfato de sódio (20 mM; pH 4,8) e azida de sódio (0,02%) a 37 °C durante a noite. As enzimas foram inactivadas por aquecimento a 100 °C durante 5 min. O material solúvel foi recuperado por centrifugação (18.000×g, 10 min, 20 °C) e liofilizado. O isolamento do pnWTA ligado a pequenos fragmentos de PGN foi obtido por um GPC final usando as condições mencionadas acima.

NMR espectroscopia

NMR medidas espectroscópicas foram realizadas em D2O a 300 K em um Bruker AvanceIII 700 MHz (equipado com uma crioproteína quádrupla de 5 mm de ressonância inversa Z-grad). Os solventes deuterados foram adquiridos da Deutero GmbH (Kastellaun, Alemanha). A acetona foi utilizada como padrão externo para calibrar os espectros 1H (δH 2.225) e 13C (δC 30.89) NMR. 31P Espectros NMR (δP 0,0) foram calibrados com 85% de ácido fosfórico em D2O como padrão externo. Os espectros de 1H NMR foram confirmados por experimentos bidimensionais 1H, 1H COSY e TOCSY, e os espectros de 13C NMR foram indicados por HSQC bidimensional 1H, 13C, com base nos espectros de 1H NMR. A conectividade interresidual e outras evidências para as designações 13C foram obtidas dos experimentos bidimensionais 1H, 13C HMBC e 1H, 13C HSQC-TOCSY. A conectividade do grupo fosfato foi atribuída por experimentos bidimensionais 1H, 31P HMQC e 1H, 31P HMQC-TOCSY. Todos os dados foram adquiridos e processados usando Bruker TOPSIN V 3.0 ou superior.

Espectrometria de massa

Para analisar o pnWTA ligado a pequenos fragmentos de PGN, a ionização por electrospray de fourier-transformação de ion de ressonância ciclotrônica (ESI-FT-ICR-MS) foi realizada em um instrumento 7 Tesla APEX Qe (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) usando modo de íon negativo e uma mistura de água/propan-2-ol/7 M trietilamina/ácido acético (50:50:0.06:0.02 v/v/v/v) como solvente, conforme descrito anteriormente6. A análise da LTA tratada com hidrazina foi feita em um Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) em modo de íon negativo, usando o mesmo solvente. Uma fonte de íons Nanomato Triversa (Advion, Ithaca, EUA) foi usada com uma tensão de pulverização ajustada para -1,1 kV. A escala de massa foi calibrada externamente com glicolípidos de estrutura conhecida, e todos os espectros foram desconvoluídos de carga. Os números de massa indicados referem-se à massa monoisotópica das moléculas neutras.

Electron microscopy

Electron microscopy de varredura de emissão de campo: as bactérias foram fixadas no meio de crescimento com formaldeído a 5% e glutaraldeído a 2,5% durante 1 h em gelo e lavadas com tampão HEPES (HEPES 0,1 M, 0,09 M sacarose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Uma alíquota de 50 µl da solução bacteriana fixa foi colocada em lamelas revestidas de poli-l-lisina e deixada assentar durante 10 min. Após fixação com glutaraldeído a 2% em PBS durante 5 min à temperatura ambiente, as lamelas foram lavadas com tampão TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) antes de serem desidratadas em uma série graduada de acetona (10, 30, 50, 70, 90 e 100%) sobre gelo durante 10 min para cada etapa. As amostras na etapa 100% acetona foram autorizadas a atingir a temperatura ambiente antes de outra mudança na acetona 100% antes da secagem em ponto crítico com CO2 líquido (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). As amostras secas foram cobertas com uma película de dourado paládio com revestimento de pulverização (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) antes de serem examinadas num microscópio electrónico de varrimento de campo Zeiss Merlin (Oberkochen, Alemanha) utilizando o detector HESE2 Everhart Thornley SE e o detector SE de lente interna numa relação de 25:75 a uma tensão de aceleração de 5 kV.

Microscopia electrónica de transmissão: as bactérias foram fixadas como acima e posteriormente fixadas com tetroxido de ósmio (1% em tampão HEPES) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com tampão HEPES, as amostras foram desidratadas com 10, 30 e 50% de acetona em gelo antes da incubação em 70% de acetona com 2% de acetato de uranila durante a noite a 7 °C. As amostras foram posteriormente desidratadas com 90 e 100% de acetona sobre gelo, deixadas atingir a temperatura ambiente e posteriormente desidratadas com 100% de acetona, depois transformadas em etanol a 100%. Posteriormente, as amostras foram infiltradas com a resina acrílica aromática LRWhite. Após a polimerização por 2 dias a 50 °C, cortes ultrathin foram cortados com uma faca de diamante, coletados em redes de 3000 mesh revestidas com butvar, e retificadas com acetato aquoso de uranila a 4% por 3 min. As amostras foram imersas num TEM 910 Zeiss a uma tensão de aceleração de 80 kV e a aumentos calibrados.

Contraste e brilho foram ajustados com o Adobe Photoshop CS3.

Geração de anticorpos

Anticorpos policlonais contra CBPs analisados foram levantados em ratos usando protocolos de imunização de rotina. Resumidamente, os ratos CD-1 foram imunizados intraperitonealmente com 20 µg de proteína recombinante e o adjuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) (50:50 v/v). Nos dias 14 e 28, os ratos foram imunizados com 20 µg de proteína recombinante e o adjuvante incompleto de Freund (50:50 v/v). Os ratos foram sangrados no dia 42 e a IgG policlonal foi purificada a partir do soro usando a proteína A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha). Os anticorpos estão listados na Tabela Complementar 2.

Citometria de fluxo

S. pneumoniae D39 tipo selvagem, o seu tacto isogénico mutante, e o mutante complementado foram cultivados na fase THY medium to mid-log, colhidos a 3.275×g durante 6 min, e lavados com PBS (pH 7,4). Para quantificação do conteúdo da cápsula, uma suspensão de 100 µl contendo 4 × 108 bactérias foi incubada com anti-soros de polissacarídeo anticapsular (SSI Tipo 2, Statens Serum Institute) (1:500 em PBS) durante 30-45 min a 37 °C e 5% CO2 em placas de 96 poços (U-bottom, Greiner Bio-One). Após a lavagem, as amostras foram incubadas com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho com a marca Alexa488 (Invitrogen) (1:500 em PBS, 30-45 min, 37 °C). Após lavagem com PBS, as bactérias foram fixadas com formaldeído a 1% durante a noite a 4 °C.

A abundância de CBPs, bem como a quantidade de ácidos teicóicos em estirpes não encapsuladas do tipo selvagem D39, mutantes e complementadas foram medidas por citometria de fluxo após fixação com formaldeído a 1% durante 1 h a 4 °C. Duzentos µl de suspensões contendo 8 × 108 bactérias foram incubados com anticorpos policlonais específicos contra diferentes CBPs (1:500 em PBS), ou para a quantificação de TAs com anticorpos contra P-Cho (TEPC-15) ou antigénio Forssman (15 min a 37 °C e 5% CO2) em placas de 96 poços (U-bottom, Greiner Bio-One). Após a lavagem, as amostras foram incubadas com um anticorpo secundário de cabra anti-IgG-agaglomerado Alexa488 (Invitrogen) (15 min a 37 °C). A fluorescência foi determinada usando um FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Immunoblot analysis

S. pneumoniae D39, seu mutante isogênico tacL, e o mutante complementado foram cultivados em meio THY até atingir um A 600 de 0,35-0,45, colhidos por centrifugação a 3270×g a 4 °C por 6 min, e ressuspendidos em 1 ml de tampão PBS a pH 7,4. Um total de 2 × 108 células por poço foi carregado e rodado em um SDS-PAGE de 12% antes de ser transferido para uma membrana de nitrocelulose por meio de blotting de semidratos. As membranas foram bloqueadas durante 2 h à temperatura ambiente utilizando 5% de leite desnatado (Roth) e Tris-buffered saline (TBS; pH 7,4) e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos policlonais de rato contra diferentes CBPs (1:500 em 5% de leite desnatado + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Um anticorpo policlonal de coelho contra enolase (1:25.000 em leite desnatado a 5% + T-TBS) foi utilizado como controle de carga. As membranas foram lavadas com T-TBS, os CBPs foram detectados com a fluorescência secundária IRDye® 800CW. Goat α-mouse IgG e enolase foram detectados com o IRDye® 680RD marcado com fluorescência. A cabra α-coelho IgG foi detectada por incubação com o anticorpo apropriado (1:15.000 em leite desnatado a 5% em T-TBS) durante 45 min no escuro à temperatura ambiente; as membranas foram lavadas com T-TBS e finalmente uma vez com TBS. A varredura das membranas foi realizada utilizando um scanner Odyssey® CLx (LI-COR).

Triton X-100-ensaio de autólise induzida por T-TBS

S. pneumoniae D39 tipo selvagem, mutante, e cepa complementada foram cultivadas em THY média a média fase de ciclo, colhidas a 3275×g por 6 min, e lavadas com PBS (pH 7,4). Uma suspensão de 1 ml contendo 1 × 109 bactérias foi incubada com uma concentração final de 0,01% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) e incubada a 37 °C. A lise das células bacterianas foi monitorizada medindo a absorvância a 600 nm em pontos de tempo predefinidos.

Ensaio de aderência epitelial

A aderência pneumocócica às células epiteliais foi analisada com células A549 humanas (ATCC® CCl-185TM) como descrito48. Brevemente, células epiteliais confluentes, cultivadas em lamelas de vidro (Hartenstein; em placas de 24 poços, ~1 × 105 células por poço) foram inoculadas com 5 × 106 pneumocococos de crescimento médio-exponencial e incubadas em meio de infecção (DMEM (HyClone™) + 1% soro fetal bovino ativado pelo calor (FBS)) a 37 °C e 5% CO2. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com solução salina tampão fosfato contendo 1% de FBS (Gibco) para remover bactérias não ligadas. Posteriormente, as bactérias foram fixadas com PBS contendo 1% de para-formaldeído (PFA, Roth).

Immunofluorescência microscópica

Pneumocococos fixos, ligados a A549 células foram lavados três vezes com PBS e bloqueados por 1 h à temperatura ambiente usando PBS + 10% de FBS. Após a lavagem, as amostras foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo policlonal (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) contra pneumococos (gerados em coelho contra S. pneumoniae TIGR4 e D39, ativados por calor). Como anticorpo secundário, foi utilizado o anticorpo anti-corpo de cabra (Abcam) Alexa-Fluor488, marcado com fluorescência (1:500, 1 h, temperatura ambiente). A aderência bacteriana foi monitorizada para pelo menos 20 células por lamela de cobertura de classe, utilizando microscopia de fluorescência. Cada experimento foi repetido três vezes em duplicata. Todos os dados são relatados como média ± s.d. A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student de duas caudas não pareado. Em todas as análises, um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Experimentos de fagocitose

Ensaio de proteção antibiótica: Uma camada confluente de células monocitárias THP-1 (ATCC® TIB-202TM) cultivadas em placas de 24 poços (3 × 105 células por poço em RPMI-1640 (HyClone™) suplementadas com 10% de soro fetal bovino ativado pelo calor (FBS, Gibco)) foi diferenciada para fagócitos pela adição de 200 nmol ml-1 de forbol 12-miristato 13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich) e incubada por 48 h a 37 °C e 5% de CO2. Posteriormente, as células de THP-1 foram lavadas com RPMI-1640 suplementadas com FBS 10% de FBS ativado por calor e incubadas por mais 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Os pneumocococos de infecção prévia foram cultivados em THY até a fase de meio-log (A 600 = 0,35-0,45), centrifugados e lavados com meio de infecção (RPMI-1640 suplementado com FBS ativada pelo calor a 1%). As células THP-1 foram lavadas e infectadas com pneumococos em meio de infecção de 500 µl. A infecção foi sincronizada por centrifugação (2 min, 300×g) para iniciar um contacto simultâneo entre bactérias e fagócitos. Posteriormente, as células foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2 durante diferentes períodos de tempo. Após a infecção, as células foram lavadas com o meio de infecção e incubadas com Penicilina G (100 unidades ml-1, Sigma-Aldrich) e Gentamicina (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) durante 1 h a 37 °C e 5% CO2 para matar as bactérias extracelulares. Em seguida, os fagócitos foram lavados e lisados com 1% de saponina (Sigma-Aldrich) para liberar pneumococos intracelulares. As unidades formadoras de colónias (ufc) de bactérias intracelulares foram determinadas por bactérias em placas de ágar sangue (Oxoid)49. A morte de pneumococos intracelulares dependente do tempo foi avaliada através da morte de pneumococos extracelulares usando antibióticos, como descrito acima. Posteriormente, os fagócitos foram ainda incubados em meio de infecção por diferentes períodos de tempo (0-3 h). A ufccação bacteriana intracelular foi monitorizada como descrito acima. Todas as experiências foram repetidas quatro vezes como duplicados. Os dados foram normalizados nos ensaios de protecção antibiótica à multiplicidade da infecção (MOI) ou na matança dependente do tempo para bactérias recuperadas no ponto de tempo 0 h. Todos os ensaios foram analisados utilizando ANOVA unidireccional com correcção Bonferroni.

Mupla coloração por imunofluorescência e microscopia

Células de THP-1 diferenciadas por PMA (3 × 105 células por poço) foram cultivadas em lamelas de vidro estéreis (12 mm, Hartenstein) e infectadas com pneumocococos como descrito acima. Após a infecção, as células de THP-1 foram lavadas com meio de infecção e fixadas com 4% de para-formaldeído (Roth) durante a noite a 4 °C. As lamelas de vidro foram lavadas com PBS e bloqueadas com PBS + 10% de FBS ativado pelo calor durante 1 h. Após a lavagem, as bactérias extracelulares foram coradas com um IgG policlonal α-pneumococci (1:500) e uma cabra secundária com rótulo Alexa-Fluor488- IgG de coelho (1:500, Abcam) durante 30 min à temperatura ambiente. As lamelas de vidro foram lavadas três vezes com PBS após a permeabilização das células THP-1 com 0,1% de Triton X-100 em PBS (10 min, temperatura ambiente). Após a lavagem, os pneumococos intracelulares foram corados com uma IgG policlonal α-pneumococci (1:500) e uma cabra secundária Alexa-Fluor568-labela α-coelho IgG (1:500, Abcam) durante 30 min à temperatura ambiente. As experiências foram repetidas três vezes como duplicatas. Para análise estatística, foram analisadas 50 células por lamela de vidro para o número de bactérias intracelulares. Os dados foram normalizados para o MOI. Todos os ensaios foram analisados usando ANOVA unidirecional com correção de Bonferroni. Em todas as análises, um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Linhas celulares

Todas as linhas celulares utilizadas neste estudo foram adquiridas do ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) e foram testadas para serem micoplasma-negativas por PCR e microscopia eletrônica de varredura.

Pneumonia aguda do rato e modelo de infecção sistêmica

Ratos CD-1 fêmeas de 8 a 10 semanas (procriação, rio Charles, Sulzfeld, Alemanha) foram infectados intranasalmente com pneumocococos bioluminescentes, como descrito recentemente50. Em resumo, os pneumococos foram cultivados até a fase média-exponencial (A 600 = 0,35) em meio THY contendo 10% de soro fetal bovino ativado pelo calor. Após a centrifugação, a dose de infecção (20 µl) foi ajustada para ~2,5 × 107 ufc em PBS (pH 7,4). Para infecção nasal, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Alemanha; Rompun, Provet AG, Lyssach, Alemanha), e as bactérias foram administradas gota a gota nas narinas. A ufculação da dose de infecção foi confirmada através da aplicação de diluições em série do inóculo nas placas de ágar sangue. Os ratos foram monitorados para sobrevivência e imitados para bioluminescência em intervalos pré-definidos usando o IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, EUA). Para o modelo de infecção sistêmica, uma dose de infecção de 3 × 103 ufc foi administrada intraperitonealmente em um volume de 200 µl de PBS (pH 7,4). Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os regulamentos alemães da Sociedade de Ciência Animal Laboratorial (GV-SOLAS) e a Lei Sanitária Europeia da Federação das Associações de Ciência Animal Laboratorial (FELASA). Todos os experimentos foram aprovados pelo Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Alemanha, autorização no. 7221.3-1-056/16-1).

Dados disponíveis

Raw FASTQ files containing S. pneumoniae genomic sequence data were submitted to the EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) and stored in the Short Read Archive (SRA) under the study accession number RJEB18558. Todos os outros dados relevantes que suportam os resultados do estudo estão disponíveis neste artigo e em seus arquivos de Informações Suplementares, ou dos autores correspondentes mediante solicitação.