O advento da medicina “de precisão” é caracterizado por muitas novas melhorias no diagnóstico, prognóstico e métodos e regimes terapêuticos. Como parte desta iniciativa, tem havido um foco na minimização da quantidade de tecido necessária para testes através de procedimentos menos invasivos e mais seguros. Um método que tem despertado considerável interesse nos últimos anos é a “biópsia líquida”. Embora as definições variem quanto ao significado exato deste termo, ele pode ser amplamente considerado como a coleta de uma amostra de fluido corporal para testar biomarcadores relevantes para informar o gerenciamento do paciente. É mais comumente aplicado à coleta de sangue periférico para análise de ácidos desoxirribonucleicos tumorais (DNA) circulantes livres de células.
A primeira descrição de DNA circulante livre de células no sangue humano foi em 1948, mas isso chamou pouca atenção na comunidade científica mais ampla 2. Em 1977, cientistas identificaram a presença de níveis anormalmente altos de DNA livre de células (cfDNA) no plasma e soro de pacientes com câncer em relação a pacientes com controle de saúde e presumiu-se que este cfDNA representava principalmente DNA tumoral circulante (ctDNA)1,5. Desde esta descrição original, outras pesquisas descobriram que o aumento do cfDNA reflete geralmente uma multiplicidade de processos patológicos, incluindo condições neoplásicas malignas e benignas, doenças inflamatórias, acidentes vasculares cerebrais, traumas e sepse. Durante estes processos, os ácidos nucléicos podem ser derramados no sangue por células apoptóticas e necróticas ou por secreção controlada por células vivas2,11. Enquanto o DNA livre de células é freqüentemente usado como sinônimo de DNA tumoral circulante, deve-se lembrar que DNA circulante não tumoral e não humano também pode estar presente em uma amostra.
Embora o foco atual seja dominado pelo DNA, componentes adicionais de uma biópsia líquida incluem ácidos ribonucleicos (RNA), células tumorais circulantes (CTCs), vesículas extracelulares (EVs), e plaquetas educadas pelo tumor (TEPs). Estes últimos componentes são principalmente de interesse para a investigação. À medida que mais pesquisas translacionais são realizadas, estes componentes adicionais de uma biópsia líquida podem ter uso clínico crescente no futuro. Uma revisão destes elementos está além do escopo deste artigo e o leitor é encaminhado ao artigo por Batth et al para leitura posterior.
Technological Considerations
até recentemente, a tecnologia disponível não tem sido sensível o suficiente para detectar ctDNA e colocá-lo em uso significativo. Ao contrário dos ensaios moleculares realizados em fluidos corporais para a detecção de ácidos nucleicos de vírus e outros microorganismos que se beneficiam de quantidades relativamente grandes de ácidos nucleicos, fragmentos de ácidos nucleicos tumorais circulantes presentes em uma fração do cfDNA normal não tumoral. ctDNA são geralmente pequenos fragmentos de DNA na faixa de 140-170 pares de base (bp)3, e tipo de tumor, progressão, carga, taxas de proliferação e terapia, todos afetam a quantidade de ctDNA em uma amostra. Além disso, embora o ctDNA seja relativamente estável no plasma e soro, é removido da circulação pelo fígado e rins em poucas horas 3,4. No entanto, os avanços nos processos pré-analíticos e nos métodos de purificação têm permitido a captura, amplificação e sequenciação bem sucedida do ctDNA.
Os métodos que são atualmente utilizados para detectar ou medir o ctDNA podem ser amplamente divididos em duas categorias: reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciação de próxima geração (NGS). Os ensaios baseados em PCR geralmente têm um tempo de resposta mais rápido e são menos dispendiosos, mas normalmente só podem avaliar uma ou algumas mutações específicas de cada vez (capacidade de multiplexação limitada). As abordagens baseadas em PCR podem ser ainda subdivididas em métodos que enriquecem as sequências mutantes em relação às do tipo selvagem (não mutantes) e aquelas que conseguem a quantificação por compartimentação. Um exemplo deste último grupo é a “PCR digital” que está se tornando amplamente utilizada para a detecção e quantificação de mutações específicas e conhecidas no ctDNA. A PCR é compartimentada em milhares de pequenos volumes de reação individual, seja em um chip ou criando gotas de água em óleo. Cada compartimento ou gota contém ou não um fragmento de modelo visado e produz um sinal fluorescente se um fragmento de modelo apropriado estiver presente dentro desse volume. Ao contar os volumes fluorescentes individuais, é possível estimar o número de moléculas do modelo especificamente visado na amostra. Para múltiplos alvos testados ao mesmo tempo (multiplexação), diferentes sinais fluorescentes podem ser atribuídos a sequências de variantes específicas.
As abordagens baseadas na sequenciação da próxima geração permitem a avaliação de uma gama muito mais ampla de possíveis mutações porque a sequenciação pode detectar mutações que ocorrem em qualquer lugar dentro das regiões capturadas. Para visar regiões propensas a mutações do genoma, as bibliotecas NGS podem ser preparadas a partir do DNA plasmático usando métodos de ligadura/captura híbrida ou métodos de enriquecimento por PCR. As frações alélicas variantes são geralmente muito mais baixas em biópsias líquidas do que em biópsias teciduais, frequentemente <1%, portanto, as regiões de interesse devem ser sequenciadas mais profundamente do que em NGS de tecido tumoral primário. Além disso, a otimização extensiva dos processos pré-analíticos e analíticos precisa ser feita para maximizar a amostra de entrada e reduzir os erros de PCR e seqüenciamento. As abordagens NGS têm a importante vantagem de serem capazes de alcançar uma cobertura de mutação muito mais ampla (análise simultânea de milhares de possíveis mutações). Assim, o conhecimento prévio das mutações específicas do tumor não é necessário. Entretanto, em comparação com métodos mais simples baseados em PCR, as técnicas NGS são mais caras, demoradas e tecnicamente mais desafiadoras.
Vantagens e Desvantagens
As vantagens das biópsias líquidas residem predominantemente na natureza muito menos invasiva dos procedimentos para obtê-las em relação às biópsias tumorais padrão. Considere, por exemplo, o processo envolvido na biópsia de uma massa pulmonar. Se a massa estiver em um local acessível pela radiologia intervencionista ou biópsia cirúrgica, há risco de pneumotórax ou hemorragia, não obstante o custo de manutenção de um conjunto operatório dentro do qual se possa realizar a operação. As biópsias em meio líquido também permitem coletas mais frequentes e seriadas ao longo do tempo para proporcionar maior resolução ao comportamento dos tumores, bem como sua resposta à terapia. Por exemplo, em um estudo, pacientes com câncer colorretal que posteriormente demonstraram radiograficamente uma boa resposta ao tratamento tiveram uma queda de >90% dos níveis de ctDNA após as primeiras 2 semanas de tratamento 9. Isto mostrou estratificar o risco de recidiva após a ressecção com intenção curativa. Em outro estudo, pacientes com câncer de mama com ctDNA detectável após a ressecção tiveram um risco 25 vezes maior de recidiva 10. Estes conceitos são análogos aos testes que são feitos atualmente para malignidades hematológicas, como a leucemia mielogênica crônica (LMC) e testes em série para a presença de transcrições de fusão BCR-ABL. Finalmente, em casos em que uma biópsia tecidual não está disponível, o perfil molecular dos tumores ainda pode ser realizado via biópsia líquida.
As desvantagens importantes da biópsia líquida incluem a necessidade de um diagnóstico histológico inicial a ser obtido por biópsia tecidual. Os laboratórios que realizam esses ensaios precisam estar atentos à utilização adequada dos testes e ao potencial de “interpretação excessiva” no contexto clínico. A baixa frequência de variantes dentro do sangue periférico pode levar a taxas mais elevadas de falsos negativos e requerer esforços técnicos e conhecimentos significativamente maiores para obter resultados fiáveis.
Aplicações actuais e emergentes
O uso clínico da biópsia líquida aumentou significativamente desde 2014, quando a primeira plataforma de biópsia líquida multigene disponível comercialmente se tornou disponível. Vários ensaios estão disponíveis comercialmente e aprovados pela FDA, e alguns são considerados suficientes para a elegibilidade do tratamento pelas companhias de seguros. Por exemplo, em 2016 a FDA aprovou o Teste de Mutação EGFR v2 da cobas® para determinar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão não pequenos para receber certos inibidores de tirosina quinase EGFR. A adoção da biópsia líquida para excluir pacientes da terapia orientada tem sido muito mais lenta, principalmente devido à preocupação com falsos negativos e tecido tumoral geralmente acessível 3. O aumento da utilização clínica também tem sido impulsionado por pacientes e médicos que desejam identificar mutações de carga para uso fora do rótulo ou inscrição em ensaios clínicos.
Os usos emergentes para biópsias líquidas incluem seu uso como complemento à biópsia de perfil mutacional do tecido, avaliando a resposta ao tratamento, monitoramento de doenças residuais, detecção de recorrência de doenças e monitoramento para o surgimento de mutações de resistência 3.
Direções futuras
A especificidade esperada de mutações cancerígenas torna o ctDNA um biomarcador atraente para a detecção precoce do câncer, o que poderia ter um tremendo impacto no cuidado do paciente. No entanto, como se sabe que os tumores em estágio inicial liberam muito pouco DNA, há muitos desafios técnicos a serem superados. Embora a biopsia líquida possa ser uma ferramenta atraente para o rastreio do cancro em doentes assintomáticos, tais aplicações terão de ser cuidadosa e ponderadamente consideradas para evitar o sofrimento e o custo excessivos dos doentes devido a resultados falsos positivos. A curto prazo, as biópsias líquidas podem ser mais úteis para confirmar a malignidade em pacientes com lesões já clinicamente ou radiograficamente aparentes.
Conclusão
A literatura centrada no teste de ctDNA está em rápida expansão e evolução. As áreas de investigação em curso incluem processos pré-analíticos, fatores que afetam a taxa de detecção de ctDNA e ensaios clínicos prospectivos. É provável que vejamos um papel mais prevalente do ctDNA nos cuidados clínicos, já que a pesquisa contínua sobre CTCs, cfDNA/RNA e vesículas extracelulares irá proporcionar maior resolução para o instantâneo do estado tumoral obtido através de biópsias líquidas 4,